王玲玲，李兆河，馬貴范，王吝安

（1.威海海洋職業(yè)學(xué)院，威海市微藻種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，山東 榮成 264300;2.山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院，山東 威海 266071）

杜氏鹽藻Dunaliella salina 富含蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素和特殊生物活性物質(zhì)，在食品、醫(yī)療保健、化工和養(yǎng)殖業(yè)中具有公認(rèn)的獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。筆者由山東榮成桑溝灣分離得到一株具有優(yōu)良性狀的鹽藻，用混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)方法研究了碳酸氫鈉、葡萄糖、蔗糖和乙酸鈉等碳源和濃度對(duì)其生長(zhǎng)的影響；采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法優(yōu)化了其培養(yǎng)基中C、N、P 的濃度水平，為鹽藻大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用鹽藻分離于山東省榮成桑溝灣自然水域，經(jīng)分子鑒定為杜氏鹽藻。

葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、碳酸氫鈉、硝酸鈉、磷酸二氫鈉和硅酸鈉等為分析純?cè)噭?/p>

培養(yǎng)用水為取自山東榮成桑溝灣海區(qū)鹽度31.5 的自然海水，0.45μm 微孔濾膜抽濾，用氯化鈉調(diào)整海水鹽度至60；培養(yǎng)基采用f/2 培養(yǎng)基[2]。培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后冷卻曝氣，調(diào)pH 至8.0；鹽藻置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度26℃，光暗比12h∶12h，光照強(qiáng)度3 000～4 000Lux，每8h 振蕩1 次。

1.2 方法

1.2.1 碳源的篩選

將無(wú)機(jī)碳源（碳酸氫鈉）、有機(jī)碳源（葡萄糖、蔗糖和乙酸鈉）分別加入f/2 培養(yǎng)基中，每種碳源設(shè)4個(gè)碳素濃度梯度，分別為0.00 mol·L-1（對(duì)照組）、0.05 mol·L-1、0.10 mol·L-1和0.15mol·L-1。實(shí)驗(yàn)采用一次性培養(yǎng)方式，在250mL 三角瓶中裝入150mL培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻種接種，接種密度為0.61×106ind.·mL-1，培養(yǎng)12d，每24h 定時(shí)采樣記錄鹽藻的細(xì)胞密度。

1.2.2 鹽藻培養(yǎng)基的優(yōu)化

根據(jù)碳源篩選結(jié)果和f/2 培養(yǎng)基配方，以葡萄糖、硝酸鈉和磷酸二氫鈉為碳、氮和磷源，設(shè)計(jì)三因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)[3]，優(yōu)化鹽藻培養(yǎng)基中C、N、P 營(yíng)養(yǎng)鹽濃度，各因素水平如表1 所示。培養(yǎng)12d，每24h 定時(shí)采樣記錄鹽藻的細(xì)胞密度。

表1 三種營(yíng)養(yǎng)鹽因素水平表Tab.1 Levels of three nutrients（g·L-1）

1.3 鹽藻細(xì)胞密度的測(cè)定

用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)鹽藻的細(xì)胞密度，用V-2000 分光光度計(jì)測(cè)定相應(yīng)細(xì)胞密度下藻液的OD630，每隔24h 測(cè)定一次，繪制吸光度與藻細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出鹽藻細(xì)胞密度[4]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，運(yùn)用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。選擇單因變量多因素方差法分析碳源形式和濃度的主效應(yīng)和二者的交互效應(yīng)；對(duì)方差分析結(jié)果顯著的因素，利用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行多重比較[5]。正交試驗(yàn)采用直觀分析和單因變量多因素方差法分析C、N、P 的主效應(yīng)。差異顯著性水平為P＜0.050。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同碳源對(duì)鹽藻生長(zhǎng)的影響

如圖1～4 所示，培養(yǎng)1～3d 為延緩期，第4d 進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，第10～12d 細(xì)胞密度最高。如圖1 所示，第12d 空白對(duì)照組鹽藻細(xì)胞密度為（5.40±0.42）×106ind.·mL-1，葡萄糖組0.05mol·L-1、0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下鹽藻細(xì)胞的密度高于空白對(duì)照組，且0.10mol·L-1濃度下細(xì)胞密度為（12.56±0.44）×106mL-1，較0.05mol·L-1和0.15 mol·L-1濃度下細(xì)胞密度高；如圖2 所示，第12d 蔗糖組0.05mol·L-1、0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下鹽藻細(xì)胞密度高于空白對(duì)照組，且0.05mol·L-1濃度下細(xì)胞密度為（9.29±0.21）×106ind.·mL-1，較0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下細(xì)胞密度高；如圖3 所示，第12d乙酸鈉組0.05mol·L-1、0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下鹽藻細(xì)胞密度低于空白對(duì)照組，0.05mol·L-1濃度下細(xì)胞密度為（4.89±0.22）×106ind.·mL-1，較0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下細(xì)胞密度高；如圖4 所示，第12d 碳酸氫鈉組0.05mol·L-1、0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下的鹽藻細(xì)胞密度高于空白對(duì)照組，且0.15 mol·L-1濃度下細(xì)胞密度為（8.04±0.22）×106ind.·mL-1，較0.05mol·L-1和0.10mol·L-1濃度下細(xì)胞密度高。結(jié)果顯示，各試驗(yàn)濃度葡萄糖、蔗糖和碳酸鈉均可促進(jìn)鹽藻的生長(zhǎng)，乙酸鈉抑制鹽藻的生長(zhǎng)。

圖1 不同的葡萄糖濃度下鹽藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（n=3）Fig.1 The growth curves of green alga Dunaliella salina at different concentrations of glucose C6H12O6

圖2 不同的蔗糖濃度下鹽藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（n=3）Fig.2 The growth curves of green alga Dunaliella salina at different concentrations of sucrose C12H22O11

圖3 不同的乙酸鈉濃度下鹽藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（n=3）Fig.3 The growth curves of green alga Dunaliella salina with Different concentrations of CH3COONa

圖4 不同的碳酸氫鈉濃度下鹽藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（n=3）Fig.4 The growth curves of green alga Dunaliella salina at different concentrations of NaHCO3

由圖5 可知，第12d，0.05mol·L-1濃度下葡萄糖組與蔗糖組的細(xì)胞密度相差不大，且明顯高于碳酸鈉和乙酸鈉組；0.10mol·L-1與0.15mol·L-1濃度下，鹽藻的細(xì)胞密度由高至低為：葡萄糖組＞蔗糖組＞碳酸鈉組＞乙酸鈉組。

圖5 不同碳源條件下鹽藻生長(zhǎng)的細(xì)胞密度Fig.5 The cell density of green alga Dunaliella salina with different carbon sources

SPSS 的一般線(xiàn)性模型方差分析結(jié)果顯示：碳源和濃度都對(duì)鹽藻生長(zhǎng)的細(xì)胞密度有極顯著影響（P=0.000）（表2）。多重比較結(jié)果顯示，有利于鹽藻細(xì)胞密度增加的碳源形式表現(xiàn)為：葡萄糖＞蔗糖＞碳酸鈉＞乙酸鈉，四者之間差異極顯著；有利于鹽藻細(xì)胞密度增加的碳濃度表現(xiàn)為：0.10mol·L-1＞0.05 mol·L-1≥0.15mol·L-1＞0.00mol·L-1，其中0.05mol·L-1和0.15mol·L-1組別差異不顯著（P=0.502）。有利于鹽藻細(xì)胞密度增加，優(yōu)選葡萄糖做碳源，適宜濃度為0.10mol·L-1。

表2 碳源形式和濃度對(duì)鹽藻的細(xì)胞密度的主效應(yīng)和交互效應(yīng)檢驗(yàn)Tab.2 Analysis of main and interaction effects of carbon sources and concentration on final cell density

2.2 鹽藻培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 極差分析

如表3 正交試驗(yàn)分析所示，經(jīng)12d 培養(yǎng)，各營(yíng)養(yǎng)鹽極差分析結(jié)果為：N 源＞C 源＞P 源，各營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)鹽藻細(xì)胞密度增加的影響由大到小依次為：N源、C 源、P 源；C 源各水平的影響由大到小依次為：K2＞K3＞K1；N 源各水平的影響由大到小依次為：K3＞K2＞K1；P 源各水平的影響由大到小依次為：K3＞K2＞K1。直觀分析鹽藻優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為：葡萄糖（C 源）18.00g·L-1、硝酸鈉（N 源）0.1000g·L-1和磷酸二氫鈉（P 源）0.0075g·L-1。

表3 營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)鹽藻細(xì)胞密度增加的影響正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.3 Result analysis of the orthogonal tests on effects of nutrients on cell density of green alga Dunaliella salina

2.2.2 方差分析

由表4 可知，氮源、碳源對(duì)鹽藻細(xì)胞密度增加的影響顯著（P＜0.050），磷源的影響不顯著（P＞0.050）。各營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)鹽藻細(xì)胞密度增加的影響顯著性由大到小依次為：氮源、碳源、磷源。方差分析的結(jié)果與直觀分析的結(jié)果一致。

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of variance analysis

3 討論

微藻富含脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和多糖，光合作用效率高、生長(zhǎng)周期短、可再生，在食品、醫(yī)藥、保健品及生物能源領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[6,7]。人工大規(guī)模高效培養(yǎng)是微藻資源開(kāi)發(fā)利用的關(guān)鍵。近年來(lái)，隨著許多藻類(lèi)利用碳源的研究不斷深化，圍繞微藻異養(yǎng)或混養(yǎng)的研究逐漸展開(kāi)[8]。研究表明：混合營(yíng)養(yǎng)（Mixo-trophism）（同時(shí)進(jìn)行無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)光合作用與有機(jī)營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)方式）可以大規(guī)模高密度生產(chǎn)微藻[9]。微藻可以吸收利用水體中的HCO3-[10]。White 等[11]發(fā)現(xiàn)，添加1g/L 碳酸氫鈉可以提高四爿藻Tetraselmis suecica 和微綠球Nannochloropsis salina 的細(xì)胞密度；戴玉蓉和盧敬讓[12]在培養(yǎng)液中添加1g/L NaHCO3，明顯促進(jìn)了綠色巴夫藻3012 Pavlova viridis、亞心扁藻Platymonas subcordiformis、海水小球藻Chlorella pacifica、等鞭金藻8701 和等鞭金藻3011 的生長(zhǎng)；王星宇等[13]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中添加碳酸氫鈉顯著影響球等鞭金藻的生長(zhǎng)。

微藻細(xì)胞對(duì)有機(jī)碳化合物及其利用程度也具有偏愛(ài)性[14]。Pruvost 等[15]報(bào)道，某些微藻具有特殊的運(yùn)送系統(tǒng)，可主動(dòng)吸收培養(yǎng)基中的有機(jī)化合物，這為微藻異養(yǎng)或混合培養(yǎng)提供了依據(jù)。目前藍(lán)藻門(mén)、隱藻門(mén)、甲藻門(mén)、金藻門(mén)、黃藻門(mén)、硅藻門(mén)、裸藻門(mén)和綠藻門(mén)等8 門(mén)60 多屬的近百種微藻可以進(jìn)行異養(yǎng)或混合營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)[16]，其中某些微藻經(jīng)過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)后，生物量或有用生化產(chǎn)物大幅提高。吳慶余等[17]用批式流加葡萄糖培養(yǎng)原始小球藻Eprotothecoides，生物量超過(guò)了100g·L-1。降低鹽藻培養(yǎng)液中可溶性無(wú)機(jī)碳源含量，增加葡萄糖混合培養(yǎng)基顯著影響杜氏鹽藻的生長(zhǎng)[18]；葡萄糖濃度為30 mmol·L-1時(shí)，微綠球藻Nannochloropsis sp 的生長(zhǎng)明顯增長(zhǎng)[19]。田華等[20]研究葡萄糖碳源對(duì)螺旋藻Spirulinaplatensis 的混合營(yíng)養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度為3.0g·L-1時(shí)，干重是對(duì)照的1.29 倍。這些異養(yǎng)微藻已用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，其應(yīng)用價(jià)值主要表現(xiàn)在作為水產(chǎn)餌料和提取生化產(chǎn)物[21]。

本試驗(yàn)明確了培養(yǎng)液中適合鹽藻混合培養(yǎng)的最優(yōu)碳源為葡萄糖，與孫俊楠等[18]的研究結(jié)果相似；優(yōu)化后的培養(yǎng)基中C、N、P 營(yíng)養(yǎng)鹽濃度為：葡萄糖18.00g·L-1，硝酸鈉0.1000g·L-1，磷酸二氫鈉0.0075 g·L-1，優(yōu)化的培養(yǎng)基明顯提高了鹽藻的生長(zhǎng)量，可為鹽藻的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。為擴(kuò)大應(yīng)用范圍，在本研究的基礎(chǔ)上，未來(lái)將進(jìn)一步探討不同碳源、濃度與鹽藻的細(xì)胞化學(xué)組成的關(guān)系及其影響機(jī)制等。