基于三維石墨烯-普魯士藍構(gòu)建電化學(xué)酶傳感器用于尿酸的靈敏檢測

李鵬威 張堯 李慶蓮 高攀 賈能勤

摘?要?構(gòu)建了一種基于三維石墨烯（3D GR）-普魯士藍（PB）的電化學(xué)酶傳感器，用于尿酸的靈敏檢測。采用一步水熱法將氧化石墨烯熱還原，自組裝形成3D GR，再將PB電沉積到3D GR上，形成3D GR-PB復(fù)合物。3D GR具有大的比表面積和多孔特性，可為反應(yīng)提供更多的活性位點。電化學(xué)測試表明，基于3D GR-PB構(gòu)建的酶傳感器檢測尿酸具有較寬的線性范圍（3.75×109 ～3.75×104 mol/L）和較低的檢出限（4.21×1010 mol/L）。由于尿酸酶對催化尿酸的高度專一性，本傳感器具有較高的選擇性，為尿酸的靈敏檢測提供了一種可行的方案。

關(guān)鍵詞?三維石墨烯;?普魯士藍;?尿酸;?電化學(xué)酶傳感器

1?引 言

尿酸（UA）存在于人尿液、血清、血漿和唾液中，是人體中嘌呤的正常代謝產(chǎn)物[1～3]。血液中的尿酸含量被作為檢測白血病、肺炎、高血脂、高血糖等疾病的標志物。血液和尿液中尿酸的正常水平分別為0.13～0.46 mmol/L （2.18～7.7 mg/dL）和1.49～4.46 mmol/L（25～74 mg/dL）[4]。因此，準確檢測尿酸的含量用于疾病診斷具有重要意義。

目前，用于檢測尿酸的分析方法主要包括高效液相色譜法[5]、熒光法[6]、化學(xué)發(fā)光法[7]等，尿酸的臨床常規(guī)檢測方法有酶紫外法和酶比色法。這些方法耗時，且樣品前處理較復(fù)雜。因此，需開發(fā)簡單、快速、靈敏和準確的尿酸檢測方法。生物傳感器因其高特異性、高靈敏度、快速響應(yīng)、低成本、簡便的樣品制備方法等特點，在生物檢測領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[8～17]。電化學(xué)生物傳感器是一種對生物物質(zhì)敏感，并將其濃度轉(zhuǎn)換成電信號進行檢測的裝置，是一種固定化的生物敏感材料系統(tǒng)，用于識別組分（包括抗體、酶、抗原、細胞、組織、核酸、微生物和其它生物活性物質(zhì)）和相應(yīng)信號的傳感器。對于目標物的分析檢測，需對生物傳感器的電極進行功能化修飾，以提高體系的傳感性能。通過在電極上修飾酶，可提高傳感器的選擇性; 為提高傳感器的靈敏度和響應(yīng)強度，可在電極上修飾導(dǎo)電性好的多孔納米材料，如三維石墨烯（3D GR）泡沫。目前，關(guān)于3D GR電化學(xué)傳感器檢測UA的報道較多[18～21]。 Yue等[19]以泡沫鎳為模板合成3D GR，隨后蝕刻鎳，對UA的選擇性有所改善，但實驗條件過于苛刻。Wang等[20]以鎳粉為原材料，采用化學(xué)氣相沉積方法合成3D GR，電化學(xué)方法檢測多巴胺和UA，但合成3D GR的過程復(fù)雜，不易操作; 同時，選擇性較差，線性范圍較窄，靈敏度較低。Chen等[21]將尿酸酶固定在碳納米管上，用于檢測細胞中的UA，構(gòu)建的生物傳感器表現(xiàn)出快的響應(yīng)速度（～2 s）、低的檢出限和寬的線性范圍。

石墨烯是一種原子厚度的二維碳材料，具有高機械強度、高導(dǎo)電性和導(dǎo)熱性[22～24]、大比表面積和較高的穩(wěn)定性，并在傳感器[25]、催化[26]、能量存儲設(shè)備[27，28]和環(huán)境領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用潛力。然而，石墨烯的應(yīng)用還需將石墨烯組裝成各種各樣的宏觀結(jié)構(gòu)。3D GR是氧化石墨烯（GO）在還原過程中通過自組裝形成的三維結(jié)構(gòu)[29～31]。3D GR不僅保留了石墨烯優(yōu)異的機械、熱學(xué)和電學(xué)性能，而且具有三維多孔結(jié)構(gòu)、低密度、良好導(dǎo)電性和高比表面積等優(yōu)點，因而，在能量儲存、催化、柔性傳感器等方面具有很大的應(yīng)用潛力。普魯士藍（PB）作為分析應(yīng)用中常用的電化學(xué)介質(zhì)，已廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域，其催化H2O2還原的性質(zhì)已被用于構(gòu)建多種基于氧化酶的生物傳感器，進而用于臨床、環(huán)境和食品等領(lǐng)域的檢測分析[32～35]。

本研究構(gòu)建了一種基于三維石墨烯-普魯士藍（3D GR-PB）的電化學(xué)酶傳感器，用于檢測UA。3DGR具有較高的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)，可為PB提供更多的附著位點，同時也為尿酸酶的催化作用提供較多的活性位點[36～38]。本傳感器具有靈敏度高、選擇性和穩(wěn)定性好的優(yōu)點，對于UA的快速靈敏檢測具有潛在的應(yīng)用價值。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

ZEISS ULTRA 55掃描電子顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）; CHI 660b電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）; Micromeritics TriStar II 3020比表面積測試儀（美國麥克儀器公司）。

尿酸酶（20 U/mg，百靈威科技有限公司）; UA（≥98%，上海源葉生物科技有限公司）; GO（99.5%，1～3層，上海阿拉丁生化科技有限公司）; 殼聚糖 （98%，分子量161.16）、無水乙醇（95%）、無水FeCl3（>98%）、K3Fe（CN）6 （≥99.5%）、K4Fe（CN）6（≥99.5%）、KCl（99.99%）、KH2PO4（99.99%）、Na2HPO4（99.5%），均購自上?；瘜W(xué)試劑公司。Na2HPO4和KH2PO4用于配制磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L PBS，pH=7.4），緩沖液亦作為電解液。 所有試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

2.2?3D GR的制備

采用一步熱還原的方法制備3D GR[39]。合成步驟如下：將40 mg GO分散在20 mL水中，超聲10 min使之分散均勻，形成2 mg/mL的分散液。將分散液轉(zhuǎn)移到高壓水熱反應(yīng)釜中，160℃烘箱中反應(yīng)12 h，冷卻至室溫，將得到的固體冷凍干燥，最終產(chǎn)物即為3D GR。

2.3?三維石墨烯-普魯士藍（3D GR-PB）的制備

將3D GR修飾的電極浸入新配制的5 mmol/L K3[Fe（CN）6]、5 mmol/L FeCl3、1 mol/L KCl溶液中，在0.2～1.2 V的電壓范圍內(nèi)，三電極體系（工作電極：3D GR-PB修飾的玻碳電極; 參比電極：飽和甘汞電極; 對電極：鉑電極）下循環(huán)伏安掃描20圈[40]，掃速為20 mV/s。用水沖洗掉未聚合的浮層。將3D GR-PB修飾電極置于0.01 mol/L K2HPO4/KH2PO4-0.1 mol/L HCl緩沖溶液（pH=6）中。在掃描電位為0.2～1.1 V，掃速為50 mV/s的條件下，進行PB的循環(huán)伏安特征峰掃描，用于驗證PB是否成功電聚合到電極上。檢測電聚合成功后，用水沖洗電極，在空氣中干燥后，備用。

2.4?基于3D GR-PB電化學(xué)酶傳感器的構(gòu)建

如圖1所示，將5 mL（2 mg/mL）3D GR溶液滴在玻碳電極上（直徑3 mm），37℃烘箱中干燥。將此修飾電極浸入到新配制的5 mmol/L K3[Fe（CN）6]、5 mmol/L FeCl3、1 mol/L KCl混合溶液中，在0.2～1.2 V的電位和20 mV/s掃速下循環(huán)掃描20圈。將5 μL尿酸酶（0.05 mg/mL）溶液滴涂在電極上，37℃干燥12 h。最后，將5 μL殼聚糖溶液滴在電極上，利用殼聚糖良好的成膜性能，將上述材料牢固固定在電極上。

2.5?UA的分析檢測

在0.1 mol/L PBS緩沖液中，使用3D GR-PB修飾電極，采用差分脈沖伏安法（DPV）對UA進行檢測。構(gòu)建的電化學(xué)酶傳感器反應(yīng)機理如下：UA在尿酸酶的作用下產(chǎn)生H2O2（方程式1），此時，PB催化H2O2，在這個過程中產(chǎn)生電子并發(fā)生電子的轉(zhuǎn)移（方程式2和3），產(chǎn)生電信號。隨著UA濃度的增加，H2O2的生成量隨之增加，同時PB催化H2O2產(chǎn)生電子的數(shù)目也會增加，電流響應(yīng)強度逐漸增強，從而實現(xiàn)對UA的定量檢測。實際樣品檢測中，首先將人血清加入到0.1 mol/L PBS緩沖液中，然后加入不同濃度的UA溶液，測定響應(yīng)電流（扣除加入血清時的電流響應(yīng)強度）。具體反應(yīng)過程如下：

3?結(jié)果與討論

3.1?3D GR和3D GR-PB的表征

從圖2A～2C可見，3D GR具有多孔網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)且孔徑分布較均一，粒徑約5 μm。圖2A插圖是合成的3D GR，與文獻報道的形貌一致[41～46]。在3D GR修飾的電極上電沉積PB后，3D GR負載了很多PB納米顆粒（圖2D～2F），粒徑分布比較均一，尺寸大小相同，但PB有團聚現(xiàn)象，這可能是由于在電沉積過程中電沉積的掃描速度、掃描圈數(shù)及溶液濃度不同引起的。

在圖3A的拉曼光譜圖中，1348和1581 cm1處的峰分別對應(yīng)于3D GR的D峰和G峰，峰位發(fā)生偏移，說明G峰不夠尖銳且強度較低，而且D峰強度超過G峰強度，使得ID/IG值變大（ID/IG值的大小表示石墨烯的缺陷密集程度，比值越大，缺陷程度越大），表明 3D GR多孔結(jié)構(gòu)不規(guī)則。這是由于在制備GO時強氧化劑的加入使得原有規(guī)則排列的石墨片層之間引入了較多的含氧官能團和懸掛鍵，導(dǎo)致產(chǎn)生大量缺陷，以及碳的sp2雜化轉(zhuǎn)化為sp3，破壞了石墨的結(jié)晶性能，當GO被還原后，這些缺陷仍會部分存在，所以在拉曼圖譜中，3D GR的D峰強度超過G峰強度[47，48]。2091和2157 cm1 處的峰對應(yīng)于PB中CN基的伸縮振動峰[49]，當PB修飾到3D GR上之后，產(chǎn)物既有3D GR本身的特征峰，又有PB的特征峰，證明PB電沉積成功。將電極在0.1 mol/L PBS溶液中進行CV測試（圖3B），發(fā)現(xiàn)其在0.2和0.9 V各有一個特征峰[50]，對應(yīng)于PB的氧化還原峰，具體的反應(yīng)過程如下：

由BET測試結(jié)果（圖4A）可知，GO的比表面積為3.68 m2/g，3D GR的比表面積為199.12 m2/g，表明3D GR具有較高的比表面積。由GO和3D GR的孔徑分布圖（圖4B）可知，3D GR的孔徑約為3 nm，GO不具有孔狀結(jié)構(gòu)。

3.2?傳感器組裝過程的電化學(xué)表征及定性實驗

采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗表征了傳感器的組裝過程。如圖5A所示，與裸玻碳電極（曲線c）相比，由于3D GR具有良好的導(dǎo)電性，能夠促進電子的轉(zhuǎn)移，修飾3D GR后，電極的電流響應(yīng)增強（曲線b）。由于PB也具有良好的導(dǎo)電性，當在電極上電沉積PB后，電流響應(yīng)進一步增強（曲線a）。酶和殼聚糖導(dǎo)電性差，所以當電極分別修飾上尿酸酶（曲線d）和殼聚糖（曲線e）后，電流響應(yīng)均減弱。圖5B的阻抗圖中，高頻區(qū)的半圓直徑對應(yīng)電極的電子轉(zhuǎn)移阻抗值Ret。與裸玻碳電極（曲線c）相比，在電極上修飾3D GR（曲線b）后，Ret變小; 繼續(xù)修飾PB，Ret繼續(xù)減?。ㄇ€a））; 在電極上修飾上尿酸酶（曲線d）和殼聚糖（曲線e）后，Ret逐漸增大。從圖5A中電流響應(yīng)強度和圖5B中Ret的變化可知，此酶傳感器組裝成功。

考察了修飾電極對H2O2的電催化作用，結(jié)果如圖5C所示。隨著H2O2濃度增加，PB的還原峰的峰電流強度逐漸增強，表明PB能夠催化H2O2還原。隨著UA濃度的增加，還原峰電流響應(yīng)強度增強（圖5D），表明構(gòu)建的酶傳感器可用于UA的檢測。

3.3?實驗條件優(yōu)化

對檢測UA的實驗條件（包括底液的pH值、尿酸酶的濃度等）進行了優(yōu)化。如圖6A所示，隨著底液（0.1 mol/L PBS緩沖液）pH值增大，電流響應(yīng)強度增加，并在pH=5時達到最大。當pH值繼續(xù)增大時，電流響應(yīng)強度減小，因此選擇最佳pH=5。從圖6B可見，隨著尿酸酶濃度增加，電流響應(yīng)強度增加，當尿酸酶濃度為0.05 mg/mL時，電流強度最強，繼續(xù)增加其濃度，電流響應(yīng)強度反而減小，所以尿酸酶的最佳濃度為0.05 mg/mL。

3.4?3D GR-PB電化學(xué)酶傳感器對UA的檢測性能

圖7A是3D GR-PB/GCE在0.1 mol/L PBS緩沖溶液中對不同濃度UA的DPV曲線，隨UA濃度升

高，還原峰電流響應(yīng)強度依次增加，如圖7B所示，在3.75×109～3.75×104 mol/L濃度范圍內(nèi)，UA濃度的對數(shù)與電流響應(yīng)強度呈線性關(guān)系，I=1.153lgC-43.057（R2=0.991），檢出限（S/N=3）為4.21×1010 mol/L。相比于文獻報道的檢測UA的方法（表1），本研究構(gòu)建的電化學(xué)酶傳感器具有較寬的線性范圍以及較低的檢出限。

考察了多巴胺、抗壞血酸、葡萄糖等潛在干擾物對UA測定的干擾。在0.1 mol/L PBS緩沖液中分別加入多巴胺（3.75×105 mol/L）、抗壞血酸（3.75×105 mol/L）和葡萄糖（3.75×105 mol/L）后，還原峰電流幾乎沒響應(yīng); 當加入UA（3.75×105 mol/L）后，還原峰電流具有較高的響應(yīng)，由此可知，此傳感器具有較強的抗干擾能力。為了檢驗3D GR-PB基電化學(xué)酶傳感器的穩(wěn)定性，將傳感器在0.1 mol/L PBS中進行多次循環(huán)伏安掃描測試，還原峰的峰電流和峰電位都未發(fā)生偏移，可知此傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

3.5?血清樣品中UA的檢測

采用本方法測定了人血清中的UA濃度。人血清中UA的標準添加實驗結(jié)果如表2所示，回收率在99.4%～102.8%之間，表明此傳感器檢測血清樣品中UA的準確性高，可用于實際樣品中UA的靈敏檢測。

4?結(jié) 論

構(gòu)建了一種基于3D GR-PB的電化學(xué)酶傳感器，實現(xiàn)了對UA的靈敏檢測。由于尿酸酶對催化UA具有高度專一性，使得此傳感器具有較高的選擇性以及較強的抗干擾能力。采用高比表面積的多孔3D GR作為基底材料，能提高修飾電極的電子轉(zhuǎn)移速率。與其它方法相比，本研究構(gòu)建的電化學(xué)酶傳感器檢測UA具有較寬的線性范圍和較低的檢出限。此3D GR-PB電化學(xué)酶傳感器為UA的快速靈敏檢測提供了一種可行且有效的方法。

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