范旋燕，孫錦輝，黃帥，葉石才，喻才元，周宇，全娟花

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣東 湛江 524001）

結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，當(dāng)前治療手段以手術(shù)結(jié)合化療為主，輔以基因治療、靶向治療等，但隨治療時間延長及耐藥細胞的出現(xiàn)，其療效并不理想[1]。JS-K 作為一氧化氮前體藥物通過與細胞內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶結(jié)合并釋放一氧化氮，進而調(diào)控機體多種生命活動，包括舒張血管、抗病毒及抗腫瘤等[2-4]。JS-K 對多種腫瘤細胞增殖有抑制作用，但對人結(jié)腸癌細胞HCT116 的影響尚未明確。本研究采用不同濃度JS-K 處理HCT116 細胞，觀察其對細胞增殖及凋亡的影響，為臨床治療人結(jié)腸癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

JS-K（西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（烏拉圭Lonsera 公司），100X 抗菌-抗真菌劑、0.25%胰蛋白酶（美國Gibco 公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），細胞凍存液CELLBANKER 2（日本ZENOAQ 公司），Trizol、Texas Red-X 鬼筆環(huán)肽（美國Life Technology公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR） 引 物（ 上海生工生物工程股份有限公司），M-MLV cDNA 合成試劑盒、酶標(biāo)儀及細胞培養(yǎng)箱（中國賽默飛世爾科技有限公司），CellTiter 96?AQueous 單溶液細胞增殖檢測試劑盒（北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司），細胞周期檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司），Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide,PI）凋亡檢測試劑盒（日本Dojindo 公司），抗熒光淬滅封片劑封片（美國Vector Laboratories 公司），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），F(xiàn)ACS Canto II 流式細胞儀（美國BD 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

將人結(jié)腸癌細胞株HCT116（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司）接種于10 cm 培養(yǎng)皿，培養(yǎng)體系為含10% FBS、1%抗菌-抗真菌劑（青霉素、鏈霉素JI 兩性霉素B）的RPMI 1640 培養(yǎng)基，使用飽和濕度細胞培養(yǎng)箱于37℃、5%二氧化碳CO2環(huán)境下培養(yǎng)，待細胞融合度達70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化、傳代后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 JS-K 對HCT116 細胞增殖的影響

將對數(shù)生長期的HCT116 細胞，按每孔3 000 個細胞均勻接種于96 孔板中，待細胞貼壁12 h 后，加入含有不同濃度JS-K 的培養(yǎng)基100μl，使培養(yǎng)體系JS-K 藥 物濃 度 分別 為0.0、1.0、2.5、5.0、10.0 及20.0μmol/L，并分別作為0.0、1.0、2.5、5.0、10.0 及20.0μmol/L 組。各組設(shè)置5 個復(fù)孔，分別處理12、24、48 及72 h 后檢測細胞增殖情況。參照MTS 說明書，于不同時間點加入20μl/孔MTS，在37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀測定490 nm 處的吸光度，計算細胞增殖抑制率。

1.4 細胞周期檢測

取對數(shù)生長期的HCT116 細胞接種于6 孔板中（3×105個/孔），培養(yǎng)12 h 后，用不同濃度JS-K 處理細胞48 h，用PI 單染色流式細胞術(shù)檢測細胞周期收集各組上清液，貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min 離心10 min，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）重懸細胞，離心沉淀細胞，棄上清液，預(yù)留50μl PBS，用預(yù)冷75%乙醇于4℃固定過夜。用預(yù)冷PBS 洗滌、重懸細胞后轉(zhuǎn)移至流式管，每管加入20μl RNase A Solution，37℃水浴30 min，每管加入400μl PI Staining Solution，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測。

1.5 細胞凋亡檢測

參照1.4 的方法收集細胞，加入500μl 預(yù)先配好的1×Annexin V Binding Buffer 重懸細胞，使細胞濃度為1×106個/ml。取100μl 細胞懸液到流式管中，每管加入5μl FITC Annexin V 和PI 溶液，室溫避光孵育15 min。補加400μl 1×Annexin V Binding Buffer，用流式細胞儀檢測。

1.6 細胞形態(tài)觀察

將對數(shù)生長期的HCT116 細胞接種于置有滅菌蓋玻片的12 孔板（8×104個/孔），培養(yǎng)12 h 后，不同濃度JS-K 處理細胞48 h，棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS 洗滌2 次，加入免疫熒光固定液室溫固定30 min。用0.1% Triton X-100 透化10 min，免疫熒光洗滌液洗2 次，滴加200μl Texas Red-X 鬼筆環(huán)肽（1 ∶100 稀釋），暗盒室溫放置30 min，染色細胞骨架。用10μl DAPI 抗熒光淬滅封片劑封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.7 凋亡基因mRNA 表達檢測

取對數(shù)生長期的HCT116 細胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿（2.5×106個/皿），培養(yǎng)12 h，不同濃度JS-K 處理細胞48 h。用Trizol試劑提取樣本總RNA，利用M-MLV試劑盒合成cDNA。設(shè)計引物并用10μl qRT-PCR 反應(yīng)體系進行擴增（見表1）。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法分析基因轉(zhuǎn)錄水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism 7.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 Bcl-2 家族凋亡基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組HCT116 細胞的生長抑制率比較

不同濃度JS-K處理HCT116 細胞12、24、48及72 h 后，檢測細胞生長抑制率，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果如下：①不同時間點細胞生長抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=364.450，P=0.000）；②各組HCT16 細胞生長抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=138.237，P=0.000）；③各組細胞生長抑制率的變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.835，P=0.000）。在同一時間點，HCT116 細胞的生長抑制率隨JS-K 濃度的增加而升高；在JS-K 濃度相同時，HCT116 細胞的生長抑制率隨暴露時間的延長而升高，提示JS-K 對HCT116 細胞增殖的抑制作用呈劑量-時間依賴性。見表2和圖1。

表2 各組HCT116 細胞生長抑制率比較 （%，±s）

表2 各組HCT116 細胞生長抑制率比較 （%，±s）

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 0.0μmol/L 組 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 1.0μmol/L 組 7.19±2.20 7.86±3.96 16.49±6.87 17.17±7.03 2.5μmol/L 組 10.47±1.95 15.21±6.05 33.71±7.31 57.53±4.48 5.0μmol/L 組 12.03±2.54 19.97±4.73 49.53±7.26 68.16±5.92 10.0μmol/L 組 13.78±2.59 23.09±5.61 58.93±5.43 76.04±3.74 20.0μmol/L 組 14.96±2.15 32.43±6.47 63.26±3.69 85.03±6.08

圖1 各組HCT116 細胞生長抑制率的變化趨勢 （±s）

2.2 不同濃度JS-K 對HCT116 細胞周期的影響

各組G0/G1 期細胞比例比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；1.0、2.5、5.0、10.0及20.0μmol/L 組G0/G1 期細胞比例較0.0μmol/L 組下降。各組G2/M 期細胞比例比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），1.0、2.5、5.0、10.0 及20.0μmol/L 組G2/M 期細胞比例較0.0μmol/L 組上升，提示JS-K可阻滯HCT116細胞G2/M 期。見表3和圖2。

表3 各組G0/G1 期、G2/M 期HCT116 細胞比例比較 （%，±s）

表3 各組G0/G1 期、G2/M 期HCT116 細胞比例比較 （%，±s）

組別 G0/G1 期 G2/M 期0.0μmol/L 組 74.66±5.99 4.89±1.16 1.0μmol/L 組 71.53±5.67 8.52±1.50 2.5μmol/L 組 62.87±2.76 12.91±2.06 5.0μmol/L 組 51.13±4.85 26.47±2.35 10.0μmol/L 組 4.38±1.36 74.78±9.33 20.0μmol/L 組 1.51±0.60 84.05±7.38 F 值 194.386 143.089 P 值 0.000 0.000

圖2 JS-K 處理HCT116 細胞48 h 后周期分布

2.3 各組細胞晚期凋亡率比較

0.0、1.0、2.5、5.0、10.0 及20.0μmol/L 組 細 胞晚期凋亡率分別為（5.4±0.8）%、（28.8±3.0）%、（31.1±2.3）%、（35.2±6.1）%、（36.9±4.5）% 和（71.6±6.9）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=71.069，P=0.000）。進一步兩兩比較，1.0、2.5、5.0、10.0 及20.0μmol/L 組細胞晚期凋亡率逐漸遞增，且均高于0.0μmol/L 組（P＜0.05），提示JS-K呈濃度依賴性促進HCT116 細胞的晚期凋亡。見 圖3。

圖3 細胞凋亡流式細胞圖

2.4 不同濃度JS-K 對HCT116 細胞核及細胞骨架微絲結(jié)構(gòu)的影響

0.0μmol/L 組細胞微絲結(jié)構(gòu)分布相對均勻，相互連成網(wǎng)狀，周圍邊界清晰，有少量微絲觸角。JS-K 處理后，DAPI 染色呈核濃縮，核碎裂成大小不等的圓形小體；細胞骨架微絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不清晰，局部呈現(xiàn)溶解或者斷裂現(xiàn)象。以上結(jié)果提示，JS-K 可誘導(dǎo)HCT116細胞核碎裂及改變骨架微絲結(jié)構(gòu)的分布。見圖4。

圖4 HCT116 細胞核及細胞骨架微絲結(jié)構(gòu)變化

2.5 各組Bcl-2 家族基因 mRNA 相對表達量 比較

各 組Bax、Bik、Bim、Puma、Bcl-xL 和Mcl-1 mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。0.0、1.0、2.5 和5.0μmol/L 組Bax、Bik 及Bim mRNA 相對表達量呈上升趨勢；5.0μmol/L 組Puma mRNA 相對表達量最高；0.0、1.0、2.5 和5.0μmol/L 組Bcl-2 和Bcl-xL mRNA 相對表達量呈下降趨勢；5.0μmol/L 組Mcl-1 mRNA 相對表達量最低。見表4和圖5。

表4 各組Bcl-2 家族基因mRNA 相對表達量比較 （±s）

表4 各組Bcl-2 家族基因mRNA 相對表達量比較 （±s）

組別 Bax Bik Bim Puma Bcl-2 Bcl-xL Mcl-1 0.0μmol/L 組 1.01±0.22 1.01±0.15 1.02±0.23 1.01±0.17 1.01±0.20 1.01±0.17 1.00±0.10 1.0μmol/L 組 1.08±0.14 1.19±0.17 1.07±0.08 0.95±0.13 0.99±0.56 0.99±0.134 1.25±0.14 2.5μmol/L 組 1.67±0.16 1.22±0.09 1.16±0.19 1.29±0.30 0.94±0.24 0.91±0.10 0.89±0.15 5.0μmol/L 組 2.36±0.32 1.82±0.11 1.75±0.18 2.14±0.64 0.83±0.16 0.58±0.09 0.46±0.05 F 值 23.761 21.934 10.937 6.541 0.6593 7.208 24.54 P 值 0.000 0.000 0.003 0.015 0.600 0.012 0.000

圖5 各組Bcl-2 家族基因mRNA 相對表達量比較 （±s）

3 討論

結(jié)腸癌作為一種常見的消化道惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)嚴重威脅著人類的身心健康。盡管隨著各項研究的深入和技術(shù)的進步，結(jié)直腸癌的診斷和治療手段都有了顯著提高，但是腫瘤診斷和治療仍然面臨諸多挑戰(zhàn)[5]。臨床治療以根治手術(shù)聯(lián)合化療為主，但患者的5年生存率仍不理想，多藥耐藥性是影響結(jié)直腸癌患者化療療效的主要原因[6]。因此，開發(fā)高效、低毒的藥物是治療腫瘤的有效途徑之一。有研究報道，一氧化氮前體藥JS-K 對前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、白血病、多發(fā)性骨髓瘤及神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤等生長有抑制作 用[3，7-12]。本研究結(jié)果表明，JS-K 對人結(jié)腸癌HCT116細胞增殖和凋亡有明顯影響，且呈濃度依賴性。

有研究報道，JS-K 可抑制白血病細胞G2/M 期，誘導(dǎo)細胞早期凋亡[13]。本研究顯示，JS-K 主要阻滯HCT116 細胞G2/M 期，并誘導(dǎo)晚期凋亡，且呈濃度依賴性。細胞凋亡時細胞骨架發(fā)生相應(yīng)變化，表現(xiàn)為微絲結(jié)構(gòu)降解凝集和分布不均勻[14]。本研究熒光雙標(biāo)記結(jié)果提示，JS-K 處理HCT116 細胞后，誘導(dǎo)核濃縮和核碎裂；細胞微絲結(jié)構(gòu)和分布發(fā)生變化，局部出現(xiàn)溶解或斷裂現(xiàn)象，表明JS-K 促進HCT116 細胞凋亡。

JS-K 主要通過誘導(dǎo)細胞凋亡對腫瘤細胞產(chǎn)生抑制作用，在調(diào)控凋亡的眾多基因中，Bcl-2 家族與凋亡發(fā)生、發(fā)展最為密切。Bcl-2 家族分為2 大類：一類是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL 及Bcl-w 等；另一類是促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bid、Bik 及Bad等[15]。LIU 等[16]發(fā)現(xiàn)，JS-K 通過Bcl-2 家族蛋白調(diào)控誘導(dǎo)人肝癌HepG2 細胞凋亡。本研究結(jié)果提示，JS-K可通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Puma，下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1 蛋白表達，促進HCT116 細胞凋亡。

綜上所述，本實驗證實JS-K 對人結(jié)腸癌細胞HCT116 增殖有明顯抑制作用，同時JS-K 通過上調(diào)HCT116 細胞中Bax 和下調(diào)Bcl-2 表達，阻滯細胞G2/M 期，促進細胞的晚期凋亡。目前證實JS-K 通過以下3 條途徑抑制腫瘤細胞：①MAPK/JNK 通路；②Wnt/β-catenin 信號通路；③胱天蛋白酶信號通路。其中胱天蛋白酶信號通路是JS-K 誘導(dǎo)凋亡最重要的信號通路，JS-K 誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞HCT116 凋亡的作用機制還有待研究。