張力新，張黎明，杜培培，余?輝

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基于改進(jìn)水平集的菌落圖像智能計(jì)數(shù)算法

張力新，張黎明，杜培培，余?輝

(天津大學(xué)生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072)

針對現(xiàn)有的菌落自動識別計(jì)數(shù)方法對背景敏感、對多菌種菌落分割普適性差的缺點(diǎn)，提出一種基于改進(jìn)水平集的全自動菌落分割、計(jì)數(shù)方法．該方法利用偏置場對背景進(jìn)行建模以消除背景灰度不均影響；構(gòu)造含有終止條件的多相水平集算法實(shí)現(xiàn)菌落目標(biāo)的自適應(yīng)分割；通過極坐標(biāo)空間中凹點(diǎn)檢測實(shí)現(xiàn)粘連目標(biāo)計(jì)數(shù)修正．由天津市食品安全檢測技術(shù)研究院提供300例多菌種混雜菌落樣本做為測試集，以專家人工鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，將本方法與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法、迅數(shù)icount10兩種定量方法進(jìn)行對比，菌落密度在300CFU內(nèi)時，本方法計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率達(dá)到92.7%，對多菌種混雜菌落的計(jì)數(shù)精度、分割效果都優(yōu)于其他兩種方法．

偏置場；多相水平集；凹點(diǎn)檢測；菌落計(jì)數(shù)

菌落是細(xì)菌在一定的pH值、溫度下，通過一定時間在合適的培養(yǎng)基中形成的能被視覺識別的生長物．對培養(yǎng)成型的菌落的檢測能在很大程度上反映食品、藥品、水質(zhì)等是否符合安全標(biāo)準(zhǔn)要求[1]．自動菌落檢測技術(shù)可以大幅降低質(zhì)檢員的工作強(qiáng)度，提升檢測的準(zhǔn)確率和工作效率．根據(jù)我國菌落計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)GB4789.2—2016，當(dāng)樣本菌落密度在300CFU以下時，自動與手動計(jì)數(shù)的結(jié)果偏差不應(yīng)超過15%[2]．

目前市面上已經(jīng)有了一些比較成熟的菌落自動檢測儀器，比如法國Interscience公司的Scan系列、杭州迅數(shù)Icount系列等．國內(nèi)外學(xué)者也提出了多種菌落圖像自動分割、檢測方法．

(1) 融合距離變換、分水嶺分割及極限腐蝕等形態(tài)學(xué)處理的傳統(tǒng)計(jì)數(shù)算法[1,3-4]．該類算法可以實(shí)現(xiàn)粘連菌落的分割，提高了計(jì)數(shù)精度，但其僅對單一菌種、規(guī)則大小的類圓型菌落計(jì)數(shù)效果較好，對于背景噪聲嚴(yán)重、多菌種混雜的菌落樣本容易造成過分割和欠分割．

(2) 活動輪廓檢測算法[5]可以適用于背景灰度不均勻、邊緣較弱的類圓粒目標(biāo)的分割，但其在邊緣檢測之前需要單獨(dú)提取每個檢測目標(biāo)進(jìn)行增強(qiáng)處理，增加了計(jì)算的復(fù)雜性，且對較小的棒狀菌落分割效果較差．

(3) 基于深度學(xué)習(xí)的圖像分割方法[6-7]，如全卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(FCN)以及其分支Unet網(wǎng)絡(luò)等新興技術(shù)，近些年來被大量應(yīng)用于圖像分割問題，但其需要數(shù)量龐大的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，在實(shí)際菌落數(shù)據(jù)采集時有很大難度，且其分割的核心思想是對每個像素進(jìn)行分類，沒有充分考慮像素與像素之間的關(guān)系，忽略了在通?；谙袼胤诸惖姆指罘椒ㄖ惺褂玫目臻g規(guī)整步驟，缺乏空間一致性．

(4) 水平集算法[8-9]的核心思想是將平面中二維閉合曲線的演化問題轉(zhuǎn)換成為比其高一維的三維空間中水平集函數(shù)的演化，再用一些現(xiàn)有的數(shù)學(xué)方法解決圖像分割問題，包括變分法、解偏微分方程(PDE)等．其主要優(yōu)勢在于：避免參數(shù)化的困難，能處理圖像拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)生變化的情況，對圖像噪聲的魯棒性?更好．

目前菌落計(jì)數(shù)軟件普遍存在智能化程度低，算法魯棒性差的問題．尤其對于多菌種混雜菌落這種背景灰度不均勻、大小形態(tài)差異較大的樣本，分割效果不理想．Li等[10]提出了一種基于偏置場矯正的區(qū)域水平集算法，該方法對參數(shù)初始值不敏感且算法魯棒性較好，在MRI背景建模的應(yīng)用中取得了較為理想的效果．但該方法直接用于菌落計(jì)數(shù)時存在兩類問題：①無法實(shí)現(xiàn)粘連菌落目標(biāo)的自動分割；②迭代次數(shù)需人工設(shè)置，算法演化終止條件不明確，對于目標(biāo)形態(tài)差異較大的不同樣本難以實(shí)現(xiàn)自適應(yīng)分割．

針對上述算法種存在的這些問題，本文提出了一種改進(jìn)的水平集和極坐標(biāo)空間下凹點(diǎn)檢測相結(jié)合的自動分割計(jì)數(shù)算法．該算法引入含有偏置場矯正的三相水平集分割算法以消除背景灰度影響、提升小目標(biāo)和弱邊緣目標(biāo)的分割精度；構(gòu)造封閉區(qū)域面積信息為主要判據(jù)的終止條件，以實(shí)現(xiàn)不同樣本的自適應(yīng)分割；設(shè)計(jì)極坐標(biāo)空間下檢測凹點(diǎn)模塊，以實(shí)現(xiàn)粘連菌落的二次分割，提升計(jì)數(shù)精度．本文算法全程無需人工干預(yù)，即可實(shí)現(xiàn)菌落圖像的全自動分割和計(jì)數(shù)．

1?水平集分割

1.1?水平集建模

由于受到培養(yǎng)皿反射光、邊緣陰影和培養(yǎng)基顏色等因素的影響，培養(yǎng)皿內(nèi)影像灰度并不均勻．此外，各個菌落灰度值及形態(tài)差異很大．為了排除背景陰影的干擾、提高較小目標(biāo)和弱邊緣目標(biāo)的分割精度，同時兼顧算法效率，本文將背景灰度影響考慮為圖像成分進(jìn)行矯正，并選用了三相水平集．

首先，對圖像進(jìn)行建模得

根據(jù)上文建模，以K-means聚類算法為核心，建立三相水平集的能量泛函方程如下，通過最小化此能量泛函可得到分割結(jié)果為

式(2)等號右邊的第2和第3項(xiàng)為能量函數(shù)的正則項(xiàng)，其中第2項(xiàng)用來計(jì)算0水平集的弧長，保持迭代過程中0水平集邊界的平滑性；第3項(xiàng)為距離正則項(xiàng)，其實(shí)質(zhì)為一個懲罰函數(shù)，用來維持水平集函數(shù)在更新過程中0水平集周圍的符號距離函數(shù)性質(zhì)，確保水平集函數(shù)更新的穩(wěn)定，避免了水平集函數(shù)的重新初始化[11]．

1.2?終止條件

經(jīng)過數(shù)次的迭代后，前面建立的模型能較準(zhǔn)確地將菌落目標(biāo)分割出來，但在實(shí)際采集到的數(shù)據(jù)中，不同樣本間菌落的分布情況、大小形態(tài)等都存在著較大差異，所以很難固定一個適用于所有樣本的迭代次數(shù)．因此，本文在上述算法的基礎(chǔ)上引入迭代演化的終止條件，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的自適應(yīng)分割．

2?菌落計(jì)數(shù)

使用上述水平集模型對菌落圖像樣本分割之后，結(jié)果如圖1所示．可以看出，各類菌落輪廓都被準(zhǔn)確地分割出來，但通過局部放大圖可以看出，菌落之間還存在著粘連的問題，會影響后續(xù)的計(jì)數(shù)精度．因此，需要將粘連的菌落分割開來．

圖1?水平集分割結(jié)果及粘連部分

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，粘連菌落上存在著明顯的凹點(diǎn)．因此，只需要判斷菌落輪廓上是否存在兩個或以上的明顯凹點(diǎn)，即可檢測出粘連目標(biāo)．本文設(shè)計(jì)了一種基于極坐標(biāo)變換的凹點(diǎn)檢測算法，步驟如下.

部分粘連菌落的分割效果如圖2所示，可以看出粘連的部分被有效地分開．在實(shí)現(xiàn)粘連菌落的分割后，采用四鄰域標(biāo)準(zhǔn)遍歷搜索出分割結(jié)果中所有的連通域，對每個連通域進(jìn)行排序標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)菌落的計(jì)數(shù)(圖3)．

圖2?粘連菌落目標(biāo)分割

圖3?菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

3?實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1?實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

3.2?實(shí)驗(yàn)步驟和參數(shù)設(shè)置

算法整體流程如圖4所示．其中預(yù)處理步驟主要包括圖像灰度化和培養(yǎng)皿內(nèi)區(qū)域選取(圖5)．首先將一副RGB三通道彩色菌落圖像轉(zhuǎn)換到HSV空間，以V分量構(gòu)建灰度圖像[12]，接著去除掉不屬于檢測有效區(qū)域的培養(yǎng)皿邊緣及外圍區(qū)域．本文采用的去除方法是首先對二值化后的菌落圖像進(jìn)行形態(tài)學(xué)膨脹運(yùn)算，以獲得不含孔洞和噪聲的培養(yǎng)皿大致輪廓；隨后求該連通域的質(zhì)心，以此質(zhì)心到邊緣的最小距離為半徑作圓，即可得到一個有效的圓形掩模，用以去除圓外區(qū)域，獲得理想的培養(yǎng)皿內(nèi)部區(qū)域．

圖4?分割計(jì)數(shù)算法流程

圖5?圖像預(yù)處理及培養(yǎng)皿內(nèi)區(qū)域提取

3.3?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本文通過實(shí)驗(yàn)從分割結(jié)果和計(jì)數(shù)精度兩方面驗(yàn)證算法效果，所有樣本的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果由天津食檢院專家人工標(biāo)定給出．

將本文算法與RSF水平集算法[13]、杭州迅數(shù)公司icount10菌落分析算法進(jìn)行分割結(jié)果對比，圖6分別列出了3種算法的分割結(jié)果．接著本文用不同區(qū)間共20個批次、總計(jì)300個多菌種菌落樣本對比了本文算法、傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法、迅數(shù)icount10的計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確度．表1表現(xiàn)了在不同菌落密度區(qū)間下3種方法的計(jì)數(shù)精度統(tǒng)計(jì)結(jié)果，圖7顯示了不同密度區(qū)間下3種算法計(jì)數(shù)結(jié)果的平均誤差曲線．可以看出，隨著菌落密度的增加，3種算法的計(jì)數(shù)誤差顯著增大，這主要是因?yàn)橛幸徊糠志浞植加诃傊瑠A層中和培養(yǎng)皿的邊緣部分，無法在二維的數(shù)字圖像上反映出來.

3.4?結(jié)果分析

由圖6(a)可見，使用RSF水平集模型分割，分割結(jié)果包含大片的非菌落目標(biāo)區(qū)域，這是因?yàn)镽SF水平集模型將圖像背景中大片的灰度不均勻區(qū)域作為目標(biāo)分割了出來；圖6(b)為迅數(shù)icount10算法的分割結(jié)果，可見該算法對于大部分灰度值較高、面積較大的類圓形菌落目標(biāo)分割效果較好，但通過圖6(b)中標(biāo)記可以看出，仍有部分目標(biāo)的分割不夠準(zhǔn)確，且該算法基本無法分割灰度值較低、面積較小的菌落目標(biāo)，這主要是因?yàn)樵撍惴〞⒑捅尘盎叶容^為接近的小目標(biāo)當(dāng)作背景噪聲篩除掉．與前兩種算法相比，本文算法(圖6(c))準(zhǔn)確地找到了所有的菌落目標(biāo)，并且分割邊緣較為平滑，經(jīng)專家鑒定，本文分割結(jié)果與實(shí)際菌落邊緣基本一致．

表1?不同誤差、密度區(qū)間下各算法樣本數(shù)統(tǒng)計(jì)

Tab.1?Number of samples statistics of each algorithms in different error and density ranges

注：逗號前為統(tǒng)計(jì)樣本數(shù)，逗號后為樣本占比.

由表1和圖7可見，在菌落密度較小的樣本中，3種算法都能達(dá)到符合國家標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)數(shù)精度，但隨著菌落密度的增加，本文算法計(jì)數(shù)精度要明顯優(yōu)于迅數(shù)icount10算法和傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法；當(dāng)菌落樣本密度達(dá)到200～300CFU時，本文算法精度優(yōu)勢尤其明顯．這是因?yàn)殡S著菌落密度的增加，圖像中含有更多小型、模糊的菌落目標(biāo)，且粘連菌落目標(biāo)的數(shù)目顯著增多，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)生偏差．

本文提出的改進(jìn)水平集模型和極坐標(biāo)凹點(diǎn)檢測相結(jié)合的菌落分割計(jì)數(shù)方法，相比之前的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法、RSF水平集和迅數(shù)icount10算法，具有更高的分割精度和計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率，其主要原因是：本文方法采用偏差矯正有效消除了灰度不均勻的背景對菌落目標(biāo)分割帶來的干擾，又通過引入基于面積信息的終止條件有效地解決了傳統(tǒng)水平集算法人工干預(yù)程度高、分割邊緣不夠準(zhǔn)確的問題；同時，本文采用極坐標(biāo)空間凹點(diǎn)檢測方法，有效地識別出了粘連菌落并將其分割，提升了后續(xù)計(jì)數(shù)的精度．

圖6?3種算法分割的結(jié)果

圖7?各算法在不同密度區(qū)間下計(jì)數(shù)平均誤差

4?結(jié)?語

針對現(xiàn)有圖像處理方法對多菌種混雜的復(fù)雜菌落樣本分割不夠精準(zhǔn)、計(jì)數(shù)誤差大的問題，本文首先去除采集到菌落圖像的培養(yǎng)皿外區(qū)域，排除外區(qū)域的干擾；然后用背景灰度偏差矯正的三相區(qū)域水平集方法對菌落圖像進(jìn)行分割，得到包含粘連目標(biāo)的菌落輪廓；再對每個菌落輪廓進(jìn)行極坐標(biāo)凹點(diǎn)檢測，判斷其是否存在粘連情況并將粘連輪廓從凹點(diǎn)處進(jìn)行分割；最后通過連通域的依次標(biāo)記實(shí)現(xiàn)菌落的計(jì)數(shù)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該算法在分割、計(jì)數(shù)等方面的效果都優(yōu)于傳統(tǒng)的菌落識別算法，計(jì)數(shù)結(jié)果誤差小于10%，且不受圖像背景灰度情況、菌落大小和形態(tài)等條件影響，能實(shí)現(xiàn)菌落的全自動分割和計(jì)數(shù)．同時，該算法也適用于其他類圓粒目標(biāo)的自動識別，能有效提升其分割、計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性．

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Intelligent Counting Algorithm for Colony Image Based on Improved Level Set

Zhang Lixin，Zhang Liming，Du Peipei，Yu Hui

(Key Laboratory of Biomedical Testing Technology and Instruments，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

The current colony counting methods are sensitive to background and are inefficient from the viewpoint of the universality of multi-species colony segmentation. To overcome this limitation，an automatic colony segmentation and counting method based on an improved level set is proposed. Here in，the bias field is used to model the background to eliminate the influence of intensity inhomogeneity. A multiphase level set algorithm with termination condition is constructed to realize adaptive segmentation of colony target. Through the concave point detection in polar coordinates，the correction of adhesion targets counting is achieved. The algorithm is tested on 300samples of multi-species colonies provided by Tianjin Food Safety Inspection Technology Research Institute. The algorithm is compared with two quantitative methods：traditional morphological algorithm and Shineso icount10 algorithm，and the results of expert artificial identification are used as gold standards. When the colony density is under 300CFU，the counting accuracy rate is up to 92.7%. Both the counting accuracy and segmentation effect of multi-species colonies using the proposed method are superior to those of the other two algorithms.

bias field；multiphase level set；concave point detection；colony counting

TP391.41

A

0493-2137(2019)01-0084-06

2018-04-18；

2018-09-10.

張力新（1963—??），男，碩士，研究員，lxzhang@tju.edu.cn.

余?輝，yuhui@tju.edu.cn.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(61475116)；天津市科技支撐資助項(xiàng)目(16YFZCNC00690，16ZXCXSF00040)；天津市北辰區(qū)科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(D-2017-NYKJXM-08).

the National Natural Science Foundation of China(No.61475116)，the Tianjin Science and Technology Program(No.16YFZCNC 00690，No.16ZXCXSF00040)，the Tianjin Beichen District Science and Technology Development Project(No.D-2017-NYKJXM-08).

10.11784/tdxbz201804071

(責(zé)任編輯：孫立華)