胞外組蛋白與急性器官損傷的關(guān)系

王宏鑫，王 萌，張煜偉，李光宗 綜述 王力軍 審校

組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白。細(xì)胞內(nèi)組蛋白由五種蛋白構(gòu)成：H2A、H2B、H3、H4以八聚體的形式，組成核小體的核心結(jié)構(gòu)；H1位于核小體以外，穩(wěn)定染色質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。H1、H2A和H2B富含賴氨酸，而H3和H4主要由精氨酸組成。作為核小體骨架，胞內(nèi)組蛋白具有維持染色體穩(wěn)定、參與DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及修復(fù)等功能[1]。若胞內(nèi)組蛋白易位至細(xì)胞外，即為細(xì)胞外組蛋白(extracellular histone, EH)。EH通過影響TLR2/TLR4/TLR9信號(hào)通路、增加細(xì)胞膜通透性介導(dǎo)炎性反應(yīng)、激活血小板及中性粒細(xì)胞等，對(duì)腦、心臟、肺臟、肝臟、腎臟和胰腺等造成損傷，甚至發(fā)生多器官衰竭[2]。筆者就EH對(duì)器官損傷及其發(fā)病機(jī)制做一綜述。

1 EH的來源及影響

EH多來源于細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)染色質(zhì)發(fā)生降解，以游離組蛋白、DNA結(jié)合組蛋白(核小體)及中性粒細(xì)胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)形式釋放到胞外[3]。游離型即刻致死性明顯高于結(jié)合型。肽基精氨酸脫亞氨酶4(peptidylated arginine deaminase,PAD4)促進(jìn)組蛋白中精氨酸瓜氨酸化，誘發(fā)DNA解螺旋，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。少量組蛋白可迅速被單核巨噬細(xì)胞清除。患者感染膿毒癥等疾病時(shí)，細(xì)胞死亡釋放的組蛋白超過機(jī)體清除能力，EH水平升高。

固有免疫細(xì)胞死亡時(shí)釋放包含組蛋白的NETs，此過程稱為NETosis。NETs兼具保護(hù)和損傷機(jī)體的作用。機(jī)體感染時(shí)中性粒細(xì)胞釋放的顆粒蛋白和染色質(zhì)形成保護(hù)網(wǎng)，過濾并殺死致病菌[4]。NETosis亦可導(dǎo)致血小板聚集、血栓形成、自身免疫和細(xì)胞毒性[5]。NET誘導(dǎo)的血管內(nèi)凝血取決于H4、血小板和無機(jī)多磷酸鹽之間的相互作用[5，6]。目前尚不清楚NETosis的始動(dòng)機(jī)制[7]。但更多證據(jù)表明TLR2/TLR4和補(bǔ)體在啟動(dòng)固有免疫細(xì)胞死亡中可能發(fā)揮重要作用[8，9]。

2 EH介導(dǎo)炎性反應(yīng)的機(jī)制

2.1 通過TLR信號(hào)通路 缺血、創(chuàng)傷等觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞死亡，胞內(nèi)物質(zhì)(如組蛋白等)釋放到細(xì)胞外。這些物質(zhì)結(jié)合、激活特異Toll樣受體(toll like receptors, TLRs)，提高NF-κB介導(dǎo)的促炎因子轉(zhuǎn)錄。缺氧性線粒體功能障礙后活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加，上調(diào)TLRs。活化TLR(尤其是TLR2和TLR4)通過MyD88-依賴途徑促進(jìn)IL-6和TNF-α等促炎因子釋放。此外，TLR還介導(dǎo)損傷相關(guān)分子信號(hào)傳遞。TLR2和TLR4基因敲出小鼠模型可免于致死劑量組蛋白的危害，提示EH可能通過TLR2和TLR4發(fā)揮作用[10，11]。

在肝缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, I/R)模型中，EH介導(dǎo)TLR9活化，誘導(dǎo)IL-6和TNF-α等促炎因子釋放[12，13]。在無菌性炎性反應(yīng)中，TLR9的活化可能有助于NLRP3炎性小體的聚集。在枯否細(xì)胞中，激活的組蛋白-TLR9介導(dǎo)線粒體ROS生成及活化NLRP3炎性小體。TLR9和NLRP3基因敲除后可完全阻斷以上過程[14]。EH激活TLR9的原因可能是結(jié)合組蛋白DNA發(fā)揮DNA-TLR9-依賴的損傷相關(guān)分子的作用，同時(shí)增強(qiáng)DNA-TLR9信號(hào)傳導(dǎo)[13]。

2.2 增加胞膜通透性 EH對(duì)上皮和內(nèi)皮組織可直接產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。注射高劑量EH后，細(xì)胞活性顯著降低。Pereira等[15]首先論述陽離子組蛋白和陰離子磷脂之間的離子鍵合。EH與磷脂-磷酸二酯鍵結(jié)合后，改變膜通透性，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞功能降低[16]。C-反應(yīng)蛋白通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磷脂位點(diǎn)，阻斷EH與其結(jié)合，使其不能進(jìn)入胞內(nèi)，發(fā)揮抑制鈣內(nèi)流及保護(hù)細(xì)胞免受EH毒性的作用[17]。

此外，EH可活化血小板。血小板活化后釋放Poly P，進(jìn)而激活FⅫ和補(bǔ)體，促進(jìn)凝血和組織損傷、水腫和炎性反應(yīng)。激活的血小板和中性粒細(xì)胞，促進(jìn)NETosis，提高EH水平。此過程相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致多器官損傷[2]。

3 EH與急性器官損傷的關(guān)系

3.1 腦 腦血管病是全球發(fā)病率和病死率最高的疾病之一。栓塞致腦灌注急劇減少及不可逆性炎性神經(jīng)損傷。低氧灌注刺激胞內(nèi)核小體釋放到循環(huán)系統(tǒng)。與對(duì)照組相比，暴露于缺氧環(huán)境的小鼠核小體水平升高3倍，而缺血性卒中模型顯示核小體水平升高達(dá)7倍[18]。EH在I/R模型中的負(fù)性作用可能是對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞及血腦屏障造成直接毒性作用、提高其通透性及白細(xì)胞遷移和免疫刺激[18]。另外，EH激活血小板，再灌注期時(shí)可進(jìn)一步增加缺血風(fēng)險(xiǎn)[19]。

阿爾茨海默病和帕金森等神經(jīng)炎性疾病患者EH水平升高[20]。EH損傷膠質(zhì)細(xì)胞，影響其功能。免疫源性的小膠質(zhì)細(xì)胞在此病理過程中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)表明H1(而非核心組蛋白)通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞存活，具有劑量依賴的神經(jīng)毒性[21]。此外，H1通過激活星型膠質(zhì)細(xì)胞，提高其反應(yīng)性，發(fā)揮神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)功能。

3.2 心臟 心肌損傷與I/R后氧輸送減少、胞內(nèi)免疫源性物質(zhì)(如組蛋白)釋放有關(guān)。反復(fù)缺血常導(dǎo)致發(fā)生不可逆性心肌損傷，出現(xiàn)心力衰竭。心肌梗死早期即發(fā)現(xiàn)組蛋白積聚于心肌細(xì)胞內(nèi)，心肌損傷程度與組蛋白水平相關(guān)[22]。NETs釋放的核小體也參與心臟局部缺血后的炎性信號(hào)傳導(dǎo)。缺乏PAD4酶的小鼠心肌梗死后血核小體水平較低。能夠水解NETs的脫氧核糖核酸酶1(deoxyribonuclease1, DNase1)顯著改善心室重塑，提高局部心肌細(xì)胞存活率，改善心肌功能并減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)?？赡苁且駾Nase1分解組蛋白，預(yù)防進(jìn)一步的心臟毒性。但EH仍可隨血流傳播，損傷其他器官[23]。此外，EH尚可通過補(bǔ)體系統(tǒng)誘導(dǎo)膿毒癥心肌損傷[23]。

3.3 肺臟 輸血、創(chuàng)傷或缺血引起的急性肺損傷，常影響肺泡及內(nèi)皮細(xì)胞功能，導(dǎo)致氣體交換不足、蛋白滲出增加、細(xì)胞死亡、炎性反應(yīng)甚至呼吸衰竭。輸血后可出現(xiàn)顯著的NETs介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[24]。NETs可加重肺水腫，提高血管內(nèi)皮通透性[23]。目前尚不明確組蛋白、DNA及顆粒蛋白在NETs內(nèi)，抑或組成復(fù)合物介導(dǎo)肺的炎性反應(yīng)或細(xì)胞死亡。Caudrillier等[24]發(fā)現(xiàn)，注射EH后小鼠肺泡細(xì)胞活性明顯下降，預(yù)孵育抗組蛋白(H1-DNA、H2A、H2B和H4)抗體顯著降低NETs介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。進(jìn)一步研究顯示H1和H4(非H3)誘導(dǎo)肺細(xì)胞死亡，抗H4抗體顯著降低促炎信號(hào)傳導(dǎo)及急性肺損傷嚴(yán)重程度，而抗H3抗體無此作用[8]。

免疫組化顯示組蛋白與磷脂上的磷酸二酯鍵相互作用(類似于DNA-組蛋白結(jié)合位點(diǎn))，積聚在內(nèi)皮細(xì)胞膜周圍，導(dǎo)致膜通透性增加，鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞死亡[25]。提示游離組蛋白具有非特異性、不依賴于TLR的細(xì)胞毒性作用。此外，陰離子聚糖及聚唾液酸通過結(jié)合EH，發(fā)揮保護(hù)作用[23]。

3.4 肝臟 無菌性肝炎時(shí)EH激活枯否細(xì)胞的TLRs，啟動(dòng)細(xì)胞因子風(fēng)暴[11]。刀豆素和對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，EH水平升高，抗組蛋白治療及敲除TLR2/TLR4則具保護(hù)作用[10]。EH通過TLR4/TLR9刺激中性粒細(xì)胞形成NETs。NETs刺激免疫源性枯否細(xì)胞釋放促炎因子。與急性肺損傷不同，H3與肝損傷程度具有顯著的相關(guān)性，抗H3抗體可減輕肝損傷嚴(yán)重程度，同時(shí)降低死亡風(fēng)險(xiǎn)和血清TNF-α和IL-6水平。NETs也介導(dǎo)肝細(xì)胞毒性[26]。NETosis抑制劑、PAD4抑制劑和DNase1均可降低EH介導(dǎo)的NETs和肝損傷標(biāo)志物水平。

3.5 腎臟 急性缺血性腎損傷臨床常見，發(fā)病率和病死率高。急性腎缺血時(shí)，組蛋白通過壞死的腎小管上皮細(xì)胞釋放到細(xì)胞外。EH依劑量依賴性的方式，對(duì)腎內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性。表現(xiàn)為白細(xì)胞黏附、血管通透性增加和腎動(dòng)脈內(nèi)跨內(nèi)皮遷移。使用抗H4抗體中和組蛋白活性后，細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)降低[27]。TLR2/TLR4可能通過MyD88-NFκB及MAPK途徑，介導(dǎo)并激活促炎反應(yīng)；MyD88和TLR雙敲除的動(dòng)物，促炎反應(yīng)降低[28]。

3.6 胰腺 EH水平與胰腺腺泡壞死數(shù)量和嚴(yán)重程度緊密相關(guān)。胰腺灌注降低后即出現(xiàn)胰腺損傷，表現(xiàn)為胰酶升高和組織炎性反應(yīng)。在膽囊結(jié)石和膽囊收縮素誘導(dǎo)的壞死性胰腺炎中，EH水平明顯升高，而單純水腫和炎性反應(yīng)不會(huì)導(dǎo)致EH升高。此外，高遷移率族組蛋白-1(high mobility group box protein-1，HMGB-1)能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和DNA斷裂，EH通過促進(jìn)固有免疫細(xì)胞分泌HMGB-1，導(dǎo)致胞內(nèi)HMGB-1水平降低，從而加劇胰腺腺泡細(xì)胞DNA損傷[1]。胰腺炎時(shí)EH水平升高能與HMGB-1缺乏有關(guān)[29]?？笻3抗體可能有助于胰腺炎的治療[29]。

總之，EH通過TLR信號(hào)通路、增加胞膜通透性 等機(jī)制，導(dǎo)致機(jī)體腦、心臟、肺臟、肝臟、腎臟、胰腺等重要器官損傷。EH水平可反映急性器官損傷的嚴(yán)重程度，器官損傷糾正后后，其水平隨之下降。此外，EH也是治療靶點(diǎn)之一[30-33]。切斷組蛋白從胞內(nèi)向胞外易位、中和循環(huán)中組蛋白、使用EH抗體及阻斷組蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等措施，可能是將來治療的新方向。