肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和機(jī)械生長(zhǎng)因子對(duì)肛提肌成肌細(xì)胞增殖最佳作用濃度的研究

董潤(rùn)楠，宋志英

研究表明，壓力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)患者多存在肛提肌細(xì)胞的損傷[1-2]。而肛提肌衛(wèi)星細(xì)胞作為出生后肛提肌新肌纖維的唯一來(lái)源，在肛提肌損傷恢復(fù)方面具有非常重要的意義[3]。骨骼肌受損后局部微環(huán)境的改變，包括炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、炎癥因子和細(xì)胞因子的釋放等，可激活肌衛(wèi)星細(xì)胞，使其退出靜止期，進(jìn)入S期開(kāi)始分裂、增殖，并促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞，與受損肌細(xì)胞融合修復(fù)損傷肌細(xì)胞，或者多個(gè)成肌細(xì)胞融合形成肌管，進(jìn)而生成新的肌細(xì)胞，發(fā)揮骨骼肌損傷后再生和修復(fù)作用[4-6]。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)、機(jī)械生長(zhǎng)因子(mechano growth factor，MGF)均可促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖[7-10]，本研究用不同濃度的HGF、MGF干預(yù)體外培養(yǎng)的人肛提肌成肌細(xì)胞，旨在篩選出HGF、MGF的最佳作用濃度，并在最佳作用濃度下，檢測(cè)肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mDNA的表達(dá)，探索HGF、MGF對(duì)SUI治療作用的可能機(jī)制，為今后局部注射生長(zhǎng)因子治療SUI提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 MGF、HGF購(gòu)自上海Novoprotein公司；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購(gòu)自上海吉爾生化有限公司；胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自以色列BI公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；異硫氰酸熒光素(flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；兔抗橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白抗體(Rabbit Anti-Sarcomeric Alpha Actinin)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒、超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肛提肌成肌細(xì)胞復(fù)蘇及鑒定 前期課題組原代分離正常產(chǎn)婦、妊娠期SUI患者肛提肌成肌細(xì)胞，傳代培養(yǎng)至第3代，經(jīng)α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白鑒定，選擇對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的成肌細(xì)胞凍存。

從液氮罐中取出凍存管，一次性手套包裹，用鑷子迅速將其置于37～40 ℃的溫水中并不斷攪動(dòng)，使凍存管中的凍存物在1 min之內(nèi)解凍。于超凈臺(tái)中打開(kāi)凍存管，迅速將成肌細(xì)胞懸液吸到裝有10 mL培養(yǎng)基(配制：DMEM+20%FBS+雙抗)的離心管中，混勻，用移液槍將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)基本恢復(fù)正常后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)浸洗已爬好細(xì)胞的培養(yǎng)皿3次，每次3 min。4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min。0.5% Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次5 min。移液槍吸干PBS，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加牛血清白蛋白溶液(5% BSA)，37℃封閉30 min，移液槍吸掉封閉液，不洗。培養(yǎng)皿內(nèi)滴加足夠量的稀釋好的一抗Rabbit Anti-Sarcomeric Alpha Actinin(1:250)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min。移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗FITC(1∶200)，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min。滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBS洗去多余的DAPI。20%甘油封閉培養(yǎng)皿，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像(綠色熒光為檢測(cè)的目的蛋白，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)肛提肌成肌細(xì)胞增殖活力

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將SUI組肛提肌成肌細(xì)胞分為兩組：HGF組、MGF組，兩組再分別設(shè)8個(gè)濃度組：50、100、150、200、400、600、800、1 000 ng/mL，以SUI組(0 ng/mL)為空白對(duì)照，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.2.2 細(xì)胞鋪板 顯微鏡下觀察到細(xì)胞狀態(tài)良好且細(xì)胞的融合度達(dá)到90%以上時(shí)，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，加入1 mL胰蛋白酶(0.25%)消化3 min，再加入完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞吹打下來(lái)并吸取到10 mL離心管中，1 500 r/min離心3 min，棄上清，加入培養(yǎng)基(配制：DMEM+10%FBS+雙抗)，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)方法將細(xì)胞密度重懸為1×104/mL，將重懸后的細(xì)胞加至96孔板中(每孔100 μL)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2.3 細(xì)胞加藥 顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿70%～80%時(shí)換無(wú)血清培養(yǎng)液，孵育24 h使細(xì)胞同步化于G0期，將配制好的HGF、MGF各個(gè)濃度梯度的藥物溶液對(duì)應(yīng)加入96孔板中，每孔1 μL，空白對(duì)照組加入1 μL生長(zhǎng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2.2.4 MTT比色法檢測(cè) 在細(xì)胞加藥72 h后，每孔加入50 μL的MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4 h后吸出上清液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩器振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值。計(jì)算公式：細(xì)胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)Laminin、Dystrophin mRNA的表達(dá) ①將肛提肌成肌細(xì)胞分為4組：正常對(duì)照組、SUI組(0 ng/mL)、HGF組、MGF組(HGF組、MGF組均在最佳作用濃度下)，用反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)法檢測(cè)肛提肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。②建立20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系[dNTP Mix(4 μL )+Primer Mix(2 μL)+RNA Template(7 μL)+5x RT Buffer(4 μL)+DTT(2 μL)+HiFiScript(1 μL)]，將RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA。③設(shè)計(jì)、合成引物，見(jiàn)表1。④建立25 μL逆轉(zhuǎn)錄體系[RNase Free dH20(9.5 μL)+cDNA/DNA(1 μL)+上游引物(1 μL)+下游引物(1 μL)+2xULtraSYBR Mixture(12.5 μL)]。⑤滿足PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性(95 ℃/10 min)、變性(95 ℃/1 s)、退火(57 ℃/30 s)、延伸(72 ℃/30 s)，循環(huán)40次。⑥以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct比較法算出各組肛提肌成肌細(xì)胞中Laminin、Dystrophin mRNA的相對(duì)表達(dá)量(在P<0.05的情況下，如果2-△△Ct<1，說(shuō)明目的基因在試驗(yàn)組中表達(dá)下調(diào)；2-△△Ct>1說(shuō)明表達(dá)上調(diào)；否則表達(dá)無(wú)差異)。

表1 引物信息表

2 結(jié)果

2.1 肛提肌成肌細(xì)胞鑒定 正常對(duì)照組和SUI組肛提肌成肌細(xì)胞均表達(dá)骨骼肌細(xì)胞標(biāo)志性蛋白α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白，圖1、圖2。

圖1 肛提肌成肌細(xì)胞鑒定 (正常對(duì)照組)

圖2 肛提肌成肌細(xì)胞鑒定(SUI組)

2.2 不同濃度HGF、MGF對(duì)肛提肌成肌細(xì)胞存活率的影響 與SUI組(0 ng/mL)相比，HGF組、MGF組肛提肌成肌細(xì)胞存活率均增加，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示不同濃度的HGF、MGF對(duì)SUI患者肛提肌成肌細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用；與其他濃度相比，當(dāng)濃度為150 ng/mL時(shí)，HGF組、MGF組肛提肌成肌細(xì)胞存活率最高，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表2。

表2 不同濃度HGF、MGF對(duì)肛提肌成肌細(xì)胞存活率的影響(%)

2.3 各組肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mRNA的表達(dá)情況 與正常對(duì)照組相比，SUI組(0 ng/mL)肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SUI組(0 ng/mL)相比，HGF組(150 ng/mL)、MGF組(150 ng/mL)肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表3。

表3 各組肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mRNA的轉(zhuǎn)錄(2-ΔΔCT值)

3 討論

SUI是女性的常見(jiàn)病和多發(fā)病，發(fā)病率高達(dá)18.9%[11]。該病病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說(shuō)，其中盆底組織受損的“吊床”學(xué)說(shuō)被廣泛認(rèn)可[12]。肛提肌作為盆底組織中主要支撐肌肉，當(dāng)該組織結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，就會(huì)影響盆底功能導(dǎo)致尿失禁的發(fā)生[2]。而肛提肌作為骨骼肌是有絲分裂后的組織，一旦形成，細(xì)胞分裂就不會(huì)發(fā)生在肌纖維內(nèi)。在產(chǎn)后誘導(dǎo)的肌肉生長(zhǎng)過(guò)程中，所需的增殖細(xì)胞(成肌細(xì)胞)來(lái)源于肛提肌干(衛(wèi)星)細(xì)胞池，它們是肛提肌生長(zhǎng)、修復(fù)和肥大所需的額外細(xì)胞核的來(lái)源，與肌纖維分層并置，代表肛提肌自我修復(fù)的生物學(xué)儲(chǔ)備[3]。

HGF由體內(nèi)各個(gè)組織以自分泌、旁分泌或內(nèi)分泌的形式產(chǎn)生，可與肌衛(wèi)星細(xì)胞膜表面受體C-Met結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,發(fā)揮骨骼肌再生修復(fù)作用[8-9]。MGF是胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)可變剪接的產(chǎn)物之一，由嚙齒類(lèi)動(dòng)物和人類(lèi)體內(nèi)除了肝臟以外的其他組織以自分泌或旁分泌的形式產(chǎn)生，對(duì)機(jī)械信號(hào)極為敏感，通過(guò)其E結(jié)構(gòu)域羧基端特有的氨基酸序列，獨(dú)立于IGF-1及其受體，在骨骼肌損傷后修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用[13-14]。研究表明，在產(chǎn)后、損傷后或運(yùn)動(dòng)骨骼肌局部，存在大量HGF、MGF，兩者均可激活肌衛(wèi)星細(xì)胞，促進(jìn)有絲分裂從而促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移，協(xié)同發(fā)揮促進(jìn)肌肉肥大、肌肉組織質(zhì)量增加作用[5,7-10,15-16]。

本研究用不同濃度的HGF、MGF干預(yù)體外培養(yǎng)的SUI患者的肛提肌成肌細(xì)胞，于干預(yù)后72 h用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，與SUI組(0 ng/mL)相比，HGF組、MGF組肛提肌成肌細(xì)胞存活率均增加，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這表明不同濃度的HGF、MGF對(duì)SUI患者肛提肌成肌細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，與上述結(jié)論一致。孫婧瑜和陸耀飛[10]以SD大鼠的腓腸肌衛(wèi)星細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)體外試驗(yàn)證實(shí)了MGF的促增殖作用。吳國(guó)梁和李娜[7]則對(duì)SD大鼠的腓腸肌進(jìn)行拉伸訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)拉伸訓(xùn)練后SD大鼠的腓腸肌HGF、MGF及其mRNA表達(dá)均顯著上升，同時(shí)腓腸肌濕重明顯增加，均證實(shí)了HGF、MGF在運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉生長(zhǎng)過(guò)程中的積極作用。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在0～150 ng/mL濃度范圍內(nèi)，相同作用時(shí)間下，肛提肌成肌細(xì)胞存活率隨著HGF、MGF濃度的增加而增加，這表明在0～150 ng/mL濃度范圍內(nèi)，HGF、MGF以劑量依賴性的方式促進(jìn)肛提肌成肌細(xì)胞增殖；在>150 ng/mL濃度范圍內(nèi)，促成肌細(xì)胞增殖作用逐漸減弱；與其他濃度相比，當(dāng)濃度為150 ng/mL時(shí)，HGF組、MGF組肛提肌成肌細(xì)胞存活率最高，HGF組達(dá)峰值(119.620±4.043)%，MGF組達(dá)峰值(118.339±3.525)%，這表明HGF、MGF促進(jìn)肛提肌成肌細(xì)胞增殖的最佳作用濃度為150 ng/mL。孫婧瑜和陸耀飛[10]篩選出的MGF促進(jìn)SD大鼠的腓腸肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的最佳作用濃度為25 ng/mL，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)MGF濃度為25 ng/mL、50 ng/mL 時(shí)，MGF促進(jìn)腓腸肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的效應(yīng)差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而當(dāng)MGF濃度繼續(xù)增加至200 ng/mL時(shí)，幾乎沒(méi)有促增殖作用，這與本研究中HGF、MGF對(duì)肛提肌成肌細(xì)胞的作用趨勢(shì)一致。

Laminin是由α，β和γ亞基的特定組合組成的異源三聚體蛋白，其α2鏈在骨骼肌的細(xì)胞外基質(zhì)中高表達(dá)，Dystrophin-糖蛋白復(fù)合物由幾種跨膜和外周成分組成，在骨骼肌的肌纖維膜中高表達(dá)，Dystroglycan是這種復(fù)合物的核心蛋白，外周膜蛋白α-Dystroglycan以高親和力結(jié)合層粘連蛋白α2鏈，同時(shí)與跨膜蛋白β-dystroglycan相連，后者又與結(jié)合了細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的Dystrophin相連，形成細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白之間的機(jī)械連接[17-19]。當(dāng)骨骼肌受到機(jī)械應(yīng)力刺激時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞骨架連鎖遭到破壞，進(jìn)而使肌纖維膜喪失穩(wěn)定性、Laminin依賴性信號(hào)傳導(dǎo)破壞、對(duì)肌肉收縮期間costameres側(cè)向傳遞力耐受程度降低，最終導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。

本研究顯示，SUI患者存在肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin mRNA相對(duì)表達(dá)量的降低，這說(shuō)明Laminin、Dystrophin表達(dá)降低與SUI發(fā)生相關(guān)；并且發(fā)現(xiàn)加入150 ng/mL HGF、MGF干預(yù)后，SUI患者肛提肌成肌細(xì)胞Laminin、Dystrophin的表達(dá)增加，這說(shuō)明HGF、MGF可通過(guò)促進(jìn)Laminin、Dystrophin的表達(dá)，從而在一定程度上修復(fù)SUI患者損傷的肛提肌。Dystrophin表達(dá)降低與SUI發(fā)生的相關(guān)關(guān)系在王莉娜等[20]的研究中亦得到證實(shí)。Ca??o-Benedini等[18]在右后肢固定(保持足背完全跖屈)10 d大鼠的比目魚(yú)肌中發(fā)現(xiàn)了Laminin和Dystrophin表達(dá)的增加，以此闡明固定對(duì)骨骼肌損傷治療作用的可能機(jī)制。至于HGF、MGF是如何促進(jìn)Laminin、Dystrophin表達(dá)、發(fā)揮修復(fù)治療作用的，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，外源性HGF、MGF可通過(guò)促進(jìn)肛提肌成肌細(xì)胞的增殖以及Laminin、Dystrophin的表達(dá)來(lái)修復(fù)SUI患者損傷的肛提肌，且最佳作用濃度為150 ng/mL。妊娠期和產(chǎn)后SUI通常是短期的，尿失禁癥狀多能自行恢復(fù)，但是妊娠和分娩對(duì)盆底神經(jīng)和肌肉組織的長(zhǎng)期隱性損害仍然存在，導(dǎo)致較早年齡分娩的婦女于圍絕經(jīng)期再次出現(xiàn)SUI[15]。所以對(duì)于妊娠期和產(chǎn)后SUI不能自發(fā)消退的年輕女性來(lái)說(shuō)，早期局部注射生長(zhǎng)因子療法可能是一個(gè)好的選擇，能夠更安全、有效、迅速地刺激身體的細(xì)胞以促進(jìn)組織愈合，既可以治療產(chǎn)后SUI，也可以防止SUI發(fā)展，這種療法很有前景，但需要在動(dòng)物模型和人類(lèi)中進(jìn)行詳細(xì)和長(zhǎng)期的研究，同時(shí)實(shí)施注射的最佳時(shí)間點(diǎn)也需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室和臨床研究。