茯磚茶提取物對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病的保護(hù)作用研究

胡安愷，姚立筠，趙悅伶，劉暢，王岳飛，徐平*

茯磚茶提取物對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病的保護(hù)作用研究

胡安愷1，姚立筠2，趙悅伶2，劉暢1，王岳飛2，徐平2*

1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品工程系，黑龍江 哈爾濱 150030；2. 浙江大學(xué)茶葉研究所，浙江 杭州 310058

茯磚茶是我國(guó)特有的一種黑茶。本文以茯磚茶為原料，分別制備了茯磚茶水提物（FWE）、經(jīng)95%乙醇沉后得到的醇溶物（FES）和醇沉物（FEP），并探究了3種提取物對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病的保護(hù)作用。研究表明，3種茯磚茶提取物都能夠減輕炎癥性腸病的腸道結(jié)構(gòu)損傷，其中FWE組效果最好；同時(shí)茯磚茶提取物可以顯著提升小鼠血清和腸道組織上清液中超氧化物岐化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）水平以及降低白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，且作用效果均為FWE組＞FES組＞FEP組；在蛋白水平上，F(xiàn)WE組小鼠腸道組織的NF-κB p65蛋白水平有所降低；IκBα的蛋白水平在FWE組和FES組中有所增加；核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）和血紅素氧化酶-1（HO-1）的相關(guān)蛋白水平在FWE組和FES組也有所增加。綜上所述，茯磚茶提取物可以通過(guò)抗氧化和抗炎途徑對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病發(fā)揮預(yù)防保護(hù)作用。

茯磚茶；炎癥性腸?。↖BD）；炎癥；氧化應(yīng)激

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是世界范圍內(nèi)一種高發(fā)的疾病，主要包括克羅恩?。–rohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）[1]，其中最為常見(jiàn)的是潰瘍性結(jié)腸炎。潰瘍性結(jié)腸炎的主要特征是從結(jié)腸開(kāi)始的粘膜炎癥，并且可以持續(xù)不斷地影響整個(gè)腸道。除了引發(fā)炎癥之外，常見(jiàn)的組織形態(tài)改變包括喪失杯狀細(xì)胞，破壞改變隱窩結(jié)構(gòu)，以及輕微潰瘍[2]。慢性潰瘍性結(jié)腸炎不僅使患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加200%~800%，并且因其潛在的全身性炎癥，導(dǎo)致其與其他慢性疾病的發(fā)生有關(guān)，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病等[3]。研究表明IBD與結(jié)腸氧化應(yīng)激和炎癥因子的增加以及腸道屏障功能的喪失相關(guān)聯(lián)[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎小鼠和IBD患者體內(nèi)，由腸道固有層免疫細(xì)胞分泌的IL-6（Interleukin-6，白細(xì)胞介素-6）、TNF（Tumor necrosis factor，腫瘤壞死因子）（多為TNF-α）的蛋白水平均明顯增加，表明細(xì)胞因子在IBD的發(fā)病機(jī)制中有著重要的作用[5]。

茶葉及其功能成分的抗氧化和抗炎功能使其具有防治IBD的可能。已有流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)飲茶能減少潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的發(fā)病率[6-7]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)不同茶類（包括紅茶、綠茶、黑茶）可以通過(guò)抗氧化、抗炎和調(diào)節(jié)腸道微生物對(duì)小鼠結(jié)腸炎具有一定的防治作用[8]。然而，也有研究報(bào)道EGCG（Epigallocatechin gallate，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯）可能會(huì)加劇IBD小鼠的體重下降，這與EGCG可以抑制蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的消化和吸收有關(guān)[9]。盡管茶葉對(duì)IBD存在潛在的防治作用，但不同茶類及其不同成分對(duì)IBD的作用存在差別。茯磚茶是我國(guó)特有的一類茶，其特點(diǎn)在于獨(dú)特的“發(fā)花”工藝，使得茯磚茶化學(xué)成分產(chǎn)生了不同于其他茶類的變化，造就了其獨(dú)特的品質(zhì)特點(diǎn)。研究表明，茯磚茶及其多酚、多糖等提取物具有調(diào)節(jié)腸道菌群、降脂減肥[10-14]、保護(hù)肝臟[15]、防治腹瀉[16]等功效，茯磚茶能通過(guò)增強(qiáng)腸道組織修復(fù)、調(diào)節(jié)腸道微生物和抑制結(jié)腸炎癥等途徑來(lái)維持小鼠腸道的健康[17]。然而，茯磚茶防治小鼠IBD的主要物質(zhì)基礎(chǔ)還鮮有報(bào)道。

因此，我們利用水提、醇沉等方法分別制備了茯磚茶水提取物（FWE）、富集茯磚茶多酚的醇溶提取物（FES）及富集茯磚茶多糖的醇沉提取物（FEP），并進(jìn)一步評(píng)價(jià)了3種提取物對(duì)DSS（Dextran sulfate sodium，葡聚糖硫酸鈉）誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病的預(yù)防保護(hù)作用，以及對(duì)IBD小鼠氧化應(yīng)激和炎癥因子的影響，以期為茯磚茶防治炎癥性腸炎的作用機(jī)制和應(yīng)用方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

茯磚茶購(gòu)于湖南省白沙溪茶廠股份有限公司；DSS購(gòu)于安諾倫（北京）生物科技有限公司；GSH（Glutathione，谷胱甘肽）、SOD（Super oxide dismutase，超氧化物岐化酶）、CAT（Catalase，過(guò)氧化氫酶）、IL-6、IL-1β、TNF-α試劑盒購(gòu)于科諾迪生物科技有限公司；RIPA裂解液、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟）、磷酸化蛋白酶抑制劑、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、β-actin（β-肌動(dòng)蛋白）、NF-κB（Nuclear Factor kappa-B，核因子κB） p65、IκBα（Inhibitor of NF-κB，NF-κB抑制蛋白）、HO-1（Heme oxidase -1，血紅素氧化酶-1）購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司；Nrf2（Nuclear factor erythroid-2-related factor 2，核因子E2相關(guān)因子2）購(gòu)于美國(guó)Affinity Biosciences公司；其他常規(guī)試劑購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茯磚茶提取物的制備

每次稱取茯磚茶50.0?g放入1?L錐形瓶中（總共500?g，每份50?g），加500?mL 100℃的蒸餾水在沸水浴中浸提10?min，共提取3次。趁熱減壓過(guò)濾后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至100~150?mL。將濃縮后的水浸提液冷凍干燥，凍干粉即為茯磚茶水提物（FWE）。在濃縮后的水浸提液中加入4倍體積的95%乙醇，4℃靜置24?h后，3?000?r·min-1離心5min，收集沉淀物，洗滌并冷凍干燥后即得富集多糖的茯磚茶醇沉提取物（FEP）；上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，經(jīng)冷凍干燥，即得富集多酚的茯磚茶醇溶物（FES）。

1.2.2 茯磚茶提取物成分測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18]測(cè)定總酚含量：配制2?mg·mL-1的樣品溶液，取0.1?mL樣品溶液加入10?mL具塞試管，加蒸餾水至6?mL，再加入0.5?mL 50%（∶）福林酚試劑（現(xiàn)配），混勻，5?min后加入1?mL 5%碳酸鈉溶液，加水至10?mL，室溫靜置60?min。用10?mm比色皿，以試劑空白為參比，于760?nm處測(cè)吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成樣品溶液的總酚含量。

參照文獻(xiàn)[19]測(cè)定總糖含量：配制2?mg·mL-1的樣品溶液，取0.2?mL樣品溶液加入25?mL具塞試管，以蒸餾水補(bǔ)至2.0?mL。加入1.0?mL 6%苯酚，搖勻，迅速加入5.0?mL濃硫酸，搖勻，室溫放置20?min后于490?nm處測(cè)吸光度。

參照文獻(xiàn)[19]測(cè)定糖醛酸含量：吸取0.2?mL 2?mg·mL-1的樣品溶液，以蒸餾水補(bǔ)至1.0?mL。在冰水浴中向各管加入4?mL濃硫酸，搖勻后置于85℃水浴中加熱20?min，冷卻至室溫后加0.2?mL咔唑溶液，在室溫下保持2?h，于530?nm處測(cè)吸光度。

參照文獻(xiàn)[19]測(cè)定可溶性蛋白含量：配制2?mg·mL-1的樣品溶液，取0.2?mL樣品溶液，以蒸餾水補(bǔ)至1.0?mL。加入5.0?mL考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，放置2~5?min后于595?nm處測(cè)吸光度。

參照文獻(xiàn)[18]測(cè)定氨基酸含量：吸取1?mL 2?mg·mL-1的樣品溶液加入25?mL比色管中，再加入0.5?mL pH=8.04磷酸鹽緩沖液和0.5?mL 2%茚三酮溶液，置于沸水浴中加熱15?min，冷卻后加水至10?mL。10?min后于570?nm處測(cè)吸光度。

1.2.3 動(dòng)物試驗(yàn)

選用SPF級(jí)的C57BL/6J雄性小鼠，6周齡，購(gòu)于上海斯萊克公司生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2017-0005。所有的動(dòng)物試驗(yàn)均于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)，動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)征得浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意（ZJU20190004）。小鼠于動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將試驗(yàn)小鼠（n=5）隨機(jī)分成4組，一組為炎癥性腸病對(duì)照組（Control），其余3組為處理組：FWE處理組、FES處理組和FEP處理組。分別配制小鼠飲用水進(jìn)行喂養(yǎng)：對(duì)照組給予無(wú)菌水、試驗(yàn)組給予相應(yīng)的提取物水溶液（4?mg·mL-1）；喂養(yǎng)15?d后，將DSS（2%，∶）添加至水/提取物溶液中，混合喂養(yǎng)7?d，進(jìn)行小鼠炎癥性腸炎模型造模，7?d后進(jìn)行相關(guān)后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

日常觀察指標(biāo)：每3?d進(jìn)行換水、稱量體重、測(cè)量每5只小鼠的總飲水量以及腹瀉便血情況。便血評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[20]：正常糞便得0分；輕微肉眼可見(jiàn)血絲得1分；糞便有可見(jiàn)血痕得2分；大便帶血得3分；脫肛和直腸出血得4分。腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[20]：正常糞便得0分；糞便較黃得1分；糞便呈柔軟狀得2分；糞便沒(méi)有具體形態(tài)得3分；脫肛，身體蜷縮得4分。

標(biāo)本采集：喂養(yǎng)完畢后，摘眼球取血，血液靜置1?h后，3?000?r·min-1離心20?min，取上清液置于–80℃冰箱保存，待做ELISA（Enzyme linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）檢測(cè)。取小鼠結(jié)直腸組織，用PBS（Phosphate buffer solution，磷酸鹽緩沖液）漂洗干凈后，取近肛門端的1?cm腸道組織，置于4%的甲醛中固定24?h，待做H&E（Hematoxylin eosin，蘇木精伊紅）染色。另取40?mg腸道組織，于無(wú)菌室中用含3倍雙抗?jié)舛鹊腜BS沖洗3遍，置于24孔板中，加入500?μL含10%牛血清及1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h，收集腸道組織上清液，置于–80℃保存，待做ELISA檢測(cè)。剩余腸道組織于液氮中快速封存，置于–80℃保存。

H&E染色：取4%甲醛中固定好的腸道組織。將樣本洗滌、脫水和透明、浸蠟、包埋處理后，切成5?μm厚度組織切片，放入溫水中展平，然后將切片轉(zhuǎn)移至載玻片上，45℃恒溫干燥過(guò)夜。過(guò)夜之后用二甲苯將切片進(jìn)行脫蠟，各10?min。然后用無(wú)水乙醇洗滌兩次各1?min。將切片分別用100%、95%、90%、85%和70%乙醇浸泡2?min，蒸餾水洗滌2?min。而后蘇木精染色15?min，流水15?min沖洗，0.1%伊紅染色5?min，再依次100%、95%、90%、85%和70%乙醇倒序脫水，二甲苯透明兩次各10?min，中性樹(shù)膠封片。

ELISA檢測(cè)：取各組小鼠的血清及腸道組織上清液，按照試劑盒說(shuō)明書，測(cè)定其中的GSH、SOD、CAT、IL-6、IL-1β、TNF-α指標(biāo)。

Western Blot檢測(cè)：組織塊用冷PBS洗滌2~3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿管中。加入1~2個(gè)2?mm的小磁珠，加入10倍組織體積裂解液置于勻漿機(jī)中制作勻漿，勻漿后，冰浴30?min，收集上清。將蛋白溶液按照4∶1的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性15?min。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳（濃縮膠電壓75?V，分離膠用120?V），PVDF（Polyvinylidene fluoride，聚偏氟乙烯）轉(zhuǎn)膜過(guò)夜（25?V恒壓）后，用5%脫脂牛奶封閉1?h，4℃孵育一抗3?h，用TBST（Tris buffered saline tween，洗膜緩沖液）洗3次，室溫下孵育二抗30?min后，用TBST洗3次。加入混合好的化學(xué)發(fā)光溶液充分反應(yīng)，1~2?min后進(jìn)行曝光。曝光后利用Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。各組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯磚茶提取物主要成分分析

3種茯磚茶提取物的制備流程如圖1-A所示。在水提的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步通過(guò)醇沉對(duì)多糖和多酚進(jìn)行了分離。從圖1-B中可以看出，醇沉物FEP中總酚含量顯著低于水提取物FWE和醇溶提取物FES，而總糖和糖醛酸含量相對(duì)較高；FES中酚類物質(zhì)較高，同時(shí)多糖物質(zhì)顯著低于FEP。FWE中主要活性物質(zhì)含量處于平均水平。

2.2 茯磚茶提取物對(duì)小鼠體重生長(zhǎng)及飲水量的影響

小鼠的體重質(zhì)量變化情況如圖2-A所示。試驗(yàn)前期，小鼠的體重增長(zhǎng)較為穩(wěn)定。第16天開(kāi)始用DSS喂養(yǎng)小鼠，DSS處理前3?d體重增長(zhǎng)變緩，3?d后，體重下降明顯，其中FEP的體重下降最少，F(xiàn)ES居中，F(xiàn)WE組體重下降最為明顯。小鼠的飲水量變化如圖2-B所示?？梢钥闯觯∈蟮娘嬎坎町惒淮?，但在DSS干預(yù)的第4~7天，小鼠的飲水量明顯下降。由于DSS引發(fā)的腸道炎癥反應(yīng)，小鼠從第19天開(kāi)始糞便出現(xiàn)明顯的血絲，并隨著DSS處理時(shí)間的增加，在第20、21天小鼠甚至出現(xiàn)了明顯大便帶血的情況（圖2-C）。小鼠腹瀉情況如圖2-D所示，腹瀉情況與便血情況相當(dāng)，小鼠從第19天開(kāi)始有輕微的腹瀉現(xiàn)象，且隨著天數(shù)的增加，腹瀉癥狀加劇，到第22天，通過(guò)觀察，可以發(fā)現(xiàn)糞便已無(wú)具體形態(tài)，并且部分小鼠有輕微的脫肛現(xiàn)象，身體蜷縮。由小鼠便血與腹瀉的癥狀情況觀察結(jié)果可看出，對(duì)照組和茯磚茶提取物處理組的癥狀差異不明顯。

2.3 茯磚茶提取物對(duì)小鼠腸道的影響

為進(jìn)一步考察DSS誘導(dǎo)對(duì)小鼠腸道的損傷和茯磚茶的保護(hù)作用，我們測(cè)量了小鼠的腸道長(zhǎng)度并取近肛門端1?cm處的腸道組織進(jìn)行了H&E染色。發(fā)現(xiàn)茯磚茶提取物對(duì)小鼠的腸道組織長(zhǎng)度沒(méi)有顯著影響（圖3-A和3-B）。H&E染色結(jié)果表明（圖3-C），模型組小鼠的腸道組織細(xì)胞排列紊亂，上皮細(xì)胞大量破損，腸道粘膜損壞，隱窩損壞，有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而FWE組、FES組和FEP組，損傷程度相對(duì)減輕。在FWE處理組，腸道粘膜組織結(jié)構(gòu)、腸道上皮細(xì)胞基本完整，隱窩結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)；FES組雖然仍有一定的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但粘膜組織結(jié)構(gòu)、腸道上皮細(xì)胞損傷較小，隱窩結(jié)構(gòu)破損較輕；在FEP處理組中，雖然已經(jīng)恢復(fù)了一部分的隱窩結(jié)構(gòu)，但粘膜組織結(jié)構(gòu)、腸道上皮細(xì)胞還未完全恢復(fù)，仍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。表明FWE和FES處理對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠腸道炎癥的緩解作用要好于FEP。

注：FWE：水提取物；FES：醇溶提取物；FEP：醇沉物。下同

圖2 茯磚茶提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量、飲水量、便血及腹瀉的影響

2.4 茯磚茶提取物對(duì)IBD小鼠氧化應(yīng)激和炎癥的影響

IBD伴隨著氧化應(yīng)激和炎癥的發(fā)生。為研究茯磚茶提取物對(duì)小鼠IBD的作用機(jī)制，我們首先分析了小鼠腸道局部氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥因子水平。結(jié)果表明，在IBD對(duì)照組中小鼠腸道的抗氧化酶SOD、CAT的活力以及GSH的含量較低（圖4-A—4-C），而炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α則處于較高水平（圖4-D—F）。茯磚茶提取物可以顯著提升小鼠腸道局部的抗氧化應(yīng)激能力和降低炎癥因子水平。同時(shí)，無(wú)論是對(duì)抗氧化應(yīng)激的提升還是炎癥的抑制，F(xiàn)WE的效果最為突出，其次是FES，而FEP作用相對(duì)較弱。

盡管炎癥性腸炎是局部疾病，但是卻存在潛在的全身性炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。為此，我們進(jìn)一步評(píng)價(jià)了茯磚茶提取物對(duì)IBD小鼠血清中氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥因子水平的影響（圖5-A—5-F）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IBD模型小鼠血清中SOD和CAT活性與GSH含量較低，分別只有241.8?U·mL-1、87.7?U·mL-1和7.5?ng·mL-1，茯磚茶提取物處理后SOD、CAT的活性及GSH含量顯著提升了。在血清炎癥因子水平方面，茯磚茶能顯著抑制IBD小鼠體內(nèi)的IL-6、IL-1β、TNF-α水平，效果趨勢(shì)與抗氧化一致。這些結(jié)果表明，茯磚茶提取物能顯著緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)（包括腸道局部和血清）氧化應(yīng)激和炎癥水平。

2.5 茯磚茶提取物對(duì)抗氧化和抗炎信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探究茯磚茶提取物對(duì)IBD小鼠的抗氧化和抗炎機(jī)制，我們通過(guò)western blot評(píng)價(jià)了茯磚茶提取物對(duì)小鼠腸道炎癥和抗氧化重要信號(hào)通路的影響。結(jié)果如圖6所示，F(xiàn)WE處理能顯著降低小鼠腸道組織的炎癥相關(guān)信號(hào)通路重要蛋白NF-κB p65水平，同時(shí)提升IκBα的蛋白表達(dá)水平；此外，Nrf2和HO-1是機(jī)體抗氧化相關(guān)信號(hào)通路的重要蛋白。在本試驗(yàn)中，F(xiàn)WE能顯著提高Nrf2和HO-1的表達(dá)。FES雖然能提高Nrf2和HO-1的表達(dá)，但與IBD模型組對(duì)比沒(méi)有顯著性差異。而在FEP處理組中，小鼠腸道組織中Nrf2和HO-1的表達(dá)水平與模型組相比沒(méi)有明顯提高。

注：CK：對(duì)照；FWE：水提取物；FES：醇溶提取物；FEP：醇沉物。*表示P<0.05，***表示P<0.001。下同

圖5 茯磚茶提取物對(duì)小鼠血清中抗氧化及炎癥因子的影響

圖6 茯磚茶提取物對(duì)小鼠腸道組織中炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)通路信號(hào)的影響

3 討論與結(jié)論

茯磚茶屬于黑茶的一種，因自帶“金花”——“冠突散囊菌”而備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、減肥及防治腹瀉等功效[21]。同時(shí)，茯磚茶提取物還具有增強(qiáng)腸道組織修復(fù)、調(diào)節(jié)腸道微生物和抑制腸炎癥等功能，在維護(hù)腸道健康方面顯示出良好的應(yīng)用前景[17]。茯磚茶功能的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是多酚和多糖等活性物質(zhì)，然而，不同提取工藝會(huì)導(dǎo)致活性物質(zhì)在提取物中具有不同的富集狀態(tài)，這是否會(huì)引起提取物功能的變化是一個(gè)值得關(guān)注問(wèn)題。

本試驗(yàn)中，我們通過(guò)水提醇沉的手段，得到了FWE、FES和FEP 3個(gè)茯磚茶提取物。成分分析結(jié)果表明，醇沉手段一定程度上能富集茯磚茶水提物中的多酚類和多糖類物質(zhì)，使得FES中多酚含量顯著高于FEP；而FEP中含有更高的多糖類物質(zhì)。已有研究顯示多酚[8,22]和多糖[23-24]對(duì)炎癥性腸病均有良好的防治效果。在DSS造模前15?d通過(guò)飲水?dāng)z入方式對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)而考察不同茯磚茶提取物對(duì)DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病預(yù)防效果，探究不同茯磚茶提取物的功效差異。小鼠經(jīng)過(guò)DSS誘導(dǎo)后，小鼠體重逐漸下降，腸道長(zhǎng)度縮短，結(jié)構(gòu)受到破損，隱窩和杯狀細(xì)胞損傷，且有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。雖然茯磚茶提取物處理無(wú)法直接阻止IBD的發(fā)生，但是能不同程度減輕相關(guān)損傷，且預(yù)防效果為FWE＞FES＞FEP。

正常的機(jī)體中，促炎和抗炎的細(xì)胞因子處于平衡狀態(tài)，但I(xiàn)BD機(jī)體中，腸道的細(xì)胞因子平衡狀態(tài)被打破，促炎因子表達(dá)量增加，從而引起炎癥反應(yīng)，造成腸道損傷[25-26]。NF-κB在腸道炎癥的研究中具有重要作用。正常狀態(tài)下，NF-κB與IκB以二聚體的形式形成復(fù)合物，此時(shí)其還未有活性。在炎癥機(jī)體內(nèi)，IκB蛋白激酶IKK發(fā)生活化，使IκB磷酸化并降解，IκB與NF-κB解離后，激活NF-κB使其進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB活性增加，則調(diào)控炎癥因子的反應(yīng)，如IL-6、TNF-α[27]。在本試驗(yàn)中，可以看到在DSS誘導(dǎo)Control組小鼠的血清和腸道組織上清液中，IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平較高，而3種茯磚茶提取物處理都降低了細(xì)胞因子的含量，表明茯茶提取物能有效緩解炎癥性腸炎的機(jī)體炎癥水平。在通路信號(hào)蛋白表達(dá)水平中，F(xiàn)WE組小鼠腸道組織的NF-κB p65蛋白水平有所降低，而FES和FEP組沒(méi)有明顯變化，而與NF-κB p65蛋白相結(jié)合并抑制NF-κB p65蛋白活化的IκBα蛋白水平在FWE組和FES組中有所增加，說(shuō)明FWE和FES能使腸道組織中的NF-κB與IκB的結(jié)合更加穩(wěn)定。

Nrf2是一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子，關(guān)聯(lián)到SOD和HO-1等酶的表達(dá)水平。Nrf2的激活可以抑制IκK/IκB的磷酸化及NF-κB p65的核轉(zhuǎn)錄，由此鈍化NF-κB信號(hào)通路。在炎癥損傷中，Nrf2對(duì)于炎癥信號(hào)激活和氧化應(yīng)激都具有調(diào)控作用，增加HO-1和Nrf2的蛋白意味著減少了促炎因子和氧化應(yīng)激水平[28-30]。在本試驗(yàn)中，茯磚茶提取物可以顯著提高腸炎小鼠血清和腸道組織中的SOD、CAT、GSH等酶蛋白水平，其中FWE效果最佳，而富含多糖的FEP效果最差。在氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白通路表達(dá)水平中，Nrf2和HO-1的蛋白水平在FWE組和FES組有所增加，說(shuō)明FWE和FES能夠增加小鼠腸道的抗氧化應(yīng)激能力。綜上，茯磚茶提取物可能通過(guò)活化了Nrf-2/HO-1通路，抑制NF-κB的表達(dá)來(lái)減緩DSS對(duì)小鼠腸道所帶來(lái)的損傷。

已有研究表明，兒茶素能夠緩解腸道的氧化損傷，調(diào)節(jié)與炎癥相關(guān)的氧化應(yīng)激信號(hào)通路。2017年，Gerges等[31]發(fā)現(xiàn)兒茶素能夠改善UC癥狀，穩(wěn)定肥大細(xì)胞。2018年，Rahman等[32]發(fā)現(xiàn)兒茶素能夠調(diào)控TLR4的表達(dá)來(lái)阻斷NF-κB的活化以及調(diào)控其上游IKK復(fù)合物，從而抑制炎癥因子TNF-α的表達(dá)。此外，茶黃素和EGCG能夠緩解IBD的炎癥水平，減少腸癌細(xì)胞的增殖[33]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)攝入EGCG會(huì)進(jìn)一步加劇患腸炎小鼠體重的降低[9]，EGCG能夠減少能量和營(yíng)養(yǎng)的吸收[34]，可以起到減輕肥胖者體重的效果。然而，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)不良的個(gè)體，包括IBD患者，這種作用可能是有害的。在茯磚茶發(fā)酵過(guò)程中，茶葉中多酚類物質(zhì)逐漸被聚合氧化，形成的茶黃素、茶紅素及其中間產(chǎn)物的刺激性會(huì)有所減小[35-36]。本研究也發(fā)現(xiàn)茯磚茶水提物組小鼠的體重減輕也較茯磚茶多酚組少，且小鼠腸道組織的修復(fù)也有所改善。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶對(duì)DSS誘導(dǎo)炎癥性腸炎具有一定的預(yù)防保護(hù)作用，其中FWE效果最佳，F(xiàn)ES次之，而FEP的功效不太明顯，表明茯磚茶對(duì)炎癥性腸病的功效可能是諸多功效成分的協(xié)同作用。同時(shí)，本研究中茯磚茶多糖類物質(zhì)的富集降低了茯磚茶提取物對(duì)于炎癥性腸病的功效。這些結(jié)果提示將茯磚茶在腸道健康方面應(yīng)用時(shí)需要考慮其中不同的成分組成。此外，我們研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶提取物能夠通過(guò)抗氧化和抗炎等機(jī)制來(lái)緩解DSS誘導(dǎo)的腸病，但是其中更深入的作用機(jī)制還需更進(jìn)一步研究。

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Protective Effects of Fu Brick Tea Extracts on Inflammatory Bowel Disease Induced by Dextran Sulfate Sodium in Mice

HU Ankai1, YAO Liyun2, ZHAO Yueling2, LIU Chang1, WANG Yuefei2, XU Ping2*

1. Department of dairyengineering, Northeast Agricultural University, Haerbin 150030, China; 2. Tea Research Institute, Zhejiang Univerisity, Hangzhou 310058, China

Fu brick tea is a special dark tea in China. In the present work, three extracts, including Fu brick tea water extract (FWE), Fu brick tea ethanol soluble fraction (FES) and Fu brick tea ethanol precipitation fraction(FEP), were prepared and used to further explore their protective effects on inflammatory bowel disease in mice. Researches show that all the Fu brick tea extracts could alleviate the intestinal structure damage of IBD mice. Moreover, the extracts increased the activities of SOD, CAT and the levels of GSH and reduced the levels of IL-6, IL-1β, TNF-α in serum and colon tissue supernatant of mice. Furthermore, the protein level of NF-κB p65 in the colon tissues in the FWE group was decreased compared to the model group. The protein level of IκBα was increased in the FWE group and FES group. Levels of Nrf2 and HO-1 were also increased in the FWE and FES groups. In conclusion, Fu brick tea extracts had a protective effect on IBD mice induced by DSS.

Fu brick tea, inflammatory bowel disease, inflammation, oxidative stress

S571.1；R574

A

1000-369X(2019)06-641-11

2019-07-19

2019-08-25

胡安愷，男，本科，主要從事茶葉營(yíng)養(yǎng)方面的研究。

zdxp@zju.edu.cn