王單單，郭麗娜，田會(huì)東，楊忠杰，王 瑞

（漯河市中心醫(yī)院臨床藥理科，漯河 462300）

大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率均較高[1]。目前，大腸癌的西醫(yī)治療手段以手術(shù)、放療及化療為主?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明中藥與化療聯(lián)用是綜合治療大腸癌的手段之一，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)具有增效減毒及改善患者生存質(zhì)量的作用[2]。

白花蛇舌草是以茜草科耳草屬植物1 a 生白花蛇舌草的干燥全草入藥，味苦、甘，性寒，可清熱解毒、利尿消腫[3]。半枝蓮為唇形科黃芩屬多年生草本植物，以全草入藥，味辛、苦，性寒，具有清熱解毒、化瘀利尿之功效[4]。兩者均為清熱解毒類中藥，具有清熱解毒、活血化瘀等功效，對腫瘤、炎癥療效確切，常以藥對形式出現(xiàn)在腫瘤和方、二半二白湯等各種治療腫瘤的臨床經(jīng)驗(yàn)方中[5]。研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮提取物在體內(nèi)外均可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤內(nèi)部血管生成從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，具有一定的抗結(jié)腸癌作用[6]。據(jù)報(bào)道白花蛇舌草乙醇提取物能夠抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路從而促進(jìn)人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[7]。晉小婷等[8]研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草、半枝蓮醇提取物的混合物與單味藥醇提物相比能夠顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株的生長，表明兩者配伍抗結(jié)腸癌作用會(huì)有所增強(qiáng)。近年來對白花蛇舌草及半枝蓮治療結(jié)腸癌的研究多集中在單一靶點(diǎn)及單一通路上[6-7]，然而中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同發(fā)揮藥效作用的特點(diǎn)，同時(shí)人體也是一種復(fù)雜的系統(tǒng)，故很難從單一方面闡述白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療大腸癌的機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種建立在計(jì)算機(jī)信息技術(shù)高速發(fā)展基礎(chǔ)上的研究中藥藥理新模式，其整合了系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)的方法，通過對中藥成分、作用靶點(diǎn)以及涉及的生物通路進(jìn)行分析，從而能夠系統(tǒng)闡明中藥產(chǎn)生藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)以及配伍規(guī)律等，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可闡明中藥活性成分及作用機(jī)制，預(yù)測中藥作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)新的適應(yīng)癥，從而增加中藥及其制劑的認(rèn)可度和接受度[9]。本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療大腸癌的主要物質(zhì)基礎(chǔ)和配伍機(jī)制進(jìn)行研究，以期為深入研究該藥對配伍治療結(jié)腸癌的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

1 材料與方法

1.1 白花蛇舌草-半枝蓮成分篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)（TCMSP）[10]，以半枝蓮、白花蛇舌草兩味中藥為關(guān)鍵詞搜索出與這兩味中藥相關(guān)的全部化學(xué)成分。本研究以口服生物利用度（OB）化合物類藥性（DL）作為該藥對成分的篩選條件[11-12]，并結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，最終確定本研究的候選化合物。

1.2 白花蛇舌草-半枝蓮藥對靶蛋白篩選 利用TCMSP 平臺(tái)查詢候選化合物的作用靶點(diǎn)。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫中的UniprotKB 查詢規(guī)范靶點(diǎn)名稱。

1.3 大腸癌疾病靶點(diǎn)的篩選 通過比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD），以“Colorectal cancer”為關(guān)鍵詞檢索與結(jié)腸癌相關(guān)的基因。

1.4 構(gòu)建白花蛇舌草-半枝蓮藥對成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape 3.6.1 軟件分析藥對成分-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)信息，構(gòu)建出白花蛇舌草-半枝蓮藥對成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并分析候選化合物和靶蛋白間的度值（degree）。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 通過構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)可從生物化學(xué)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)角度出發(fā)研究候選化合物和疾病相關(guān)蛋白間的相互作用關(guān)系[13]。將藥對作用的靶點(diǎn)與大腸癌相關(guān)的靶蛋白的交集蛋白導(dǎo)入STRING 10.5 數(shù)據(jù)庫中獲取蛋白質(zhì)相互作用信息，并得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 核心靶點(diǎn)的通路分析 為了進(jìn)一步分析上述篩選出的核心蛋白功能及在信號(hào)通路中的作用，將所得到白花蛇舌草－半枝蓮藥對治療大腸癌的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行生物學(xué)過程富集分析（GO）和通路富集分析（KEGG）[14]。

1.7 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集蛋白與其相關(guān)聯(lián)的藥對中成分構(gòu)建成與大腸癌相關(guān)的白花蛇舌草-半枝蓮藥對成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。交集蛋白與KEGG 富集出的生物通路構(gòu)建出大腸癌靶點(diǎn)－通路網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape 3.6.1 軟件中的合并功能將以上2 種網(wǎng)絡(luò)合并，從而得出成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選 利用TCMSP，檢索出半枝蓮包含化學(xué)成分94 種，白花蛇舌草包含化學(xué)成分37 種。通過OB 和DL 預(yù)測化學(xué)成分的成藥性，本研究基于樣本量以及文獻(xiàn)調(diào)研綜合考慮[15-16]，最終選擇OB≥30%與DL≥0.18 為篩選條件。結(jié)果顯示，半枝蓮中有29 種化學(xué)成分符合條件，白花蛇舌草有7 種化學(xué)成分符合條件，其中M98（槲皮素）、M359（谷甾醇）及M358（β-豆甾醇）為半枝蓮和白花蛇舌草的共有化學(xué)成分，共篩選出33 個(gè)候選化合物。“半枝蓮-白花蛇舌草”藥對中候選化合物的基本信息見表1。

2.2 白花蛇舌草-半枝蓮藥對成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 將藥對篩選出的成分與靶點(diǎn)間關(guān)聯(lián)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1，從而得到成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中共有266 個(gè)節(jié)點(diǎn)和625 條邊，其中有30 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)用橙色正六邊形表示，236 個(gè)靶節(jié)點(diǎn)用綠色圓點(diǎn)表示。通過限定OB 值和DL 值共篩選出33 個(gè)候選化合物，但是化合物M2719、M1646、M1663 無相關(guān)靶點(diǎn)，故在成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中只顯示了30 化合物靶點(diǎn)。在網(wǎng)絡(luò)中，1 個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)相連接的邊越多，該節(jié)點(diǎn)的度值越高。度值高的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮樞紐作用，可能為該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。在該網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)成分平均與20.83 個(gè)靶點(diǎn)存在相互作用，每個(gè)靶點(diǎn)平均與2.65 個(gè)成分相關(guān)聯(lián)，因此白花蛇舌草-半枝蓮藥對可通過多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮藥理作用。其中最多的化合物為M98 有151 個(gè)潛在靶點(diǎn)，其次是M6（木犀草素）有57 個(gè)靶點(diǎn)。這些度值較高的候選化合物，可能是“半枝蓮-白花蛇舌草”藥對發(fā)揮藥效的核心成分。具有較高度值的靶點(diǎn)為前列腺素G/H 合成酶1（PTGS1）、前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、熱休克蛋白90（HSP90），具有較高度值的靶點(diǎn)可能是藥對發(fā)揮藥效的關(guān)鍵或者上游靶點(diǎn)。

2.3 白花蛇舌草-半枝蓮與大腸癌交集靶點(diǎn) 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢出白花蛇舌草候選化合物181 個(gè)靶點(diǎn)，半枝蓮候選化合物230 個(gè)靶點(diǎn)，大腸癌403 個(gè)相關(guān)基因。通過在線韋恩圖得出半枝蓮、白花蛇舌草與大腸癌存在40 個(gè)共有基因，半枝蓮與大腸癌存在1 個(gè)共有基因。即白花蛇舌草-半枝蓮藥對候選化合物作用靶點(diǎn)與大腸癌共有41 個(gè)交集蛋白，見圖2。

2.4 白花蛇舌草-半枝蓮與大腸癌交集蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將“2.3 項(xiàng)”下得到的41 個(gè)交集蛋白導(dǎo)入STRING 10.5 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析，從而得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。圖中有41 個(gè)節(jié)點(diǎn)，357 條邊，其中節(jié)點(diǎn)代表交集蛋白，邊則表示蛋白間的關(guān)聯(lián)作用，線條的粗細(xì)表示關(guān)聯(lián)度的大小，圖中節(jié)點(diǎn)的平均度值為8.7。

2.5 靶點(diǎn)通路分析 將41 個(gè)交集蛋白上傳至DAVID 中通過GO 功能富集分析得到284 個(gè)GO 條目（P＜0.05），其中包括生物過程（BP）229 個(gè)、細(xì)胞組成（CC）22 個(gè)、分子功能（MF）33 個(gè)，見圖4。

表1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對33 個(gè)候選化合物基本信息Tab.1 Basic information of 33 candidate compounds in Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barbat Herba

通過KEGG 通路富集篩選得到80 條信號(hào)通路（P＜0.05），前35 條顯示如圖5 所示。其中包括結(jié)腸癌信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、P53 信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路及炎癥性腸病等。

2.6 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 整理大腸癌相關(guān)的成分靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)信息以及相關(guān)靶點(diǎn)通路的關(guān)聯(lián)信息如表2、表3 所示，并將這些關(guān)聯(lián)信息上傳至Cytoscape 3.6.1 軟件中，并利用該軟件的合并功能構(gòu)建白花蛇舌草-半枝蓮活性成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，如圖6 所示。圖中包括成分19 種，大腸癌相關(guān)靶點(diǎn)33 個(gè)，信號(hào)通路25 條。篩選出的該藥對候選活性成分的作用靶點(diǎn)分布在不同的信號(hào)通路，相互協(xié)調(diào)，通過調(diào)控不同的信號(hào)通路發(fā)揮治療大腸癌作用。

圖1 “半枝蓮-白花蛇舌草”成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Compound-target network of Scutellaria Barbata-Hedyotis Diffusa

圖2 白花蛇舌草-半枝蓮與大腸癌相關(guān)交集基因韋恩圖Fig.2 Intersection gene of Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barbat and colorectal cancer related target

圖3 “白花蛇舌草-半枝蓮”與大腸癌蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein-protein interaction network diagram of Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barba and colorectal cancer

圖4 白花蛇舌草-半枝蓮靶標(biāo)的GO 富集分析圖Fig.4 GO enrichment analysis of targets of Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barba

圖5 白花蛇舌草-半枝蓮治療大腸癌相關(guān)靶蛋白KEGG富集分析的35 條通路圖Fig.5 Thirty five channels of analysis of KEGG concentration in treatment of colorectal cancer by Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barbata

表2 大腸癌相關(guān)活性成分-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)信息Tab.2 Correlation information of colorectal cancer related components-target

表3 大腸癌靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)信號(hào)通路信息Tab.3 Correlation information of colorectal cancer related target-pathway

3 討論

大腸癌是一種受多種因素影響的系統(tǒng)性疾病，其發(fā)生發(fā)展過程由多種信號(hào)分子和多條生物通路調(diào)控，由于大腸癌發(fā)病機(jī)制的高度復(fù)雜性，從而單一分子單一靶點(diǎn)的治療策略很難取得滿意的效果。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過分析半枝蓮-白花蛇舌草藥對所包含的成分、作用靶點(diǎn)及調(diào)控的信號(hào)通路，建立該藥對治療大腸癌的“成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”多層次網(wǎng)絡(luò)模型，從整體角度出發(fā)研究半枝蓮-白花蛇舌草藥對發(fā)揮治療大腸癌作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理機(jī)制。

圖6 白花蛇舌草-半枝蓮治療大腸癌成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路Fig.6 Compounds-targets-pathway network of Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barba

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測到白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療大腸癌的19 個(gè)活性成分、33 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)以及25 條信號(hào)通路，該藥對治療大腸癌成分、靶點(diǎn)及信號(hào)通路的多樣性也在一定程度上體現(xiàn)了中藥治療疾病的整體性和系統(tǒng)性。通過分析成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，槲皮素、木犀草素、黃芩素、漢黃芩苷及β-谷甾醇在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)聯(lián)度較高，這幾種成分可能是白花蛇舌草、半枝蓮治療大腸癌的物質(zhì)基礎(chǔ)。據(jù)報(bào)道關(guān)聯(lián)度較高的前5 種化合物均有顯著的抗大腸癌作用[17-21]，槲皮素可通過抑制細(xì)胞周期、增加細(xì)胞凋亡、抑制血管生成和轉(zhuǎn)移等多種機(jī)制發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用[17]；黃芩素通過抑制蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路降低基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達(dá)，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲[19]。靶點(diǎn)AKT1、腫瘤抑制蛋白（TP53）、MMP-2、MMP-9、腫瘤壞死因子（TNF）及前列腺素內(nèi)源性過氧化物合酶（PTGS2）在網(wǎng)絡(luò)的中心位置可能為白花蛇舌草、半枝蓮治療大腸癌的潛在靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)涉及凋亡、細(xì)胞周期、免疫系統(tǒng)，這些生物過程與大腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，進(jìn)一步印證了白花蛇舌草、半枝蓮藥對具有治療大腸癌的作用。其中靶點(diǎn)MMP-2、MMP-9 是參與腫瘤細(xì)胞遷移侵襲和轉(zhuǎn)移的主要蛋白水解酶，研究表明MMP-2、MMP-9 的表達(dá)會(huì)影響結(jié)腸癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[22]。前列腺素合成的主要限速酶PTGS2，在心血管疾病、炎癥、腫瘤中都發(fā)揮重要作用[23]。在炎癥及促有絲分裂的刺激下會(huì)誘導(dǎo)PTGS2 的表達(dá)，進(jìn)而參與前列腺素E2的表達(dá)，前列腺素E2可參與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成及侵襲等多種生物過程[24]。臨床研究表明，在大腸癌早期治療中選擇性PTGS2抑制劑具有較顯著的抗腫瘤作用[25]。通過GO 基因分析和KEGG 通路富集分析表明白花蛇舌草、半枝蓮藥對通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖分化及增強(qiáng)機(jī)體免疫等多種途徑發(fā)揮抗大腸癌的作用，體現(xiàn)了中藥治療疾病的整體性與系統(tǒng)性。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度出發(fā)，初步闡述了白花蛇舌草-半枝蓮治療大腸癌的潛在活性成分、可能作用的靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的關(guān)鍵生物學(xué)通路，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究奠定了良好的基礎(chǔ)。當(dāng)然，本研究也存在一定的局限性，由于篇幅有限只是通過挖掘數(shù)據(jù)對白花蛇舌草-半枝蓮治療大腸癌的藥理作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，忽略了各成分含量、化合物間相互作用及藥物體內(nèi)代謝過程的影響，還需要進(jìn)一步通過藥理和臨床研究驗(yàn)證。