賈子昉，王清連，董娜

河南科技學院生命科技學院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心/河南省棉麥分子生態(tài)與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，河南新鄉(xiāng)453003

開展棉花品種的遺傳多樣性研究具有重要的意義，近年來對自育品種、亞洲棉、陸地棉等的遺傳多樣性研究越來越多，對種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究是目前育種工作者的主要任務。目前，分子標記如隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）等已被廣泛應用于棉花遺傳多樣性研究。其中，SSR 以其具有較高的多態(tài)性、共顯性、DNA 樣本用量少而被大范圍應用[1-4]。前人利用表型性狀對棉花遺傳多樣性進行了比較系統(tǒng)的研究[5-8]，但是將表型性狀與分子標記兩者同時應用于遺傳多樣性研究的報道較少。本研究中，我們主要利用SSR 標記及表型分析探討300 份種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為育種工作者提供豐富的品種遺傳多樣性信息，為合理進行親本雜交選配，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和多抗新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的300 份陸地棉種質(zhì)資源材料由河南科技學院生命科技學院的棉花種植試驗田提供（表1）。試驗材料于2016 年4 月種植于試驗田，同時開始2 年的田間表型性狀調(diào)查，室內(nèi)試驗于2018年10 月進行。

1.2 棉花基因組DNA 的提取

在棉花生長旺盛時期，每一個品種隨機任取2 株上未展平的新鮮嫩葉1～2 片，放入預冷的離心管中，立即加入600 μL 預冷的DNA 提取液，用電鉆法將嫩葉組織磨至細碎。用改良CTAB 法提取DNA[9-10]。DNA 溶解在滅菌的TE 中，濃度為50 ng/μL。

1.3 SSR 引物的篩選

隨機選取16 份種質(zhì)材料對372 對SSR 引物進行初篩，共得到72 對差異性引物。372 對SSR 引物序列信息來自棉花分子標記數(shù)據(jù)庫（CMD；http://www.cottonmarker.org），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，包括84 對BNL 引物、20 對JESPR 引物、267 對NAU 引物、1 對TMB 引物。從72 對差異性引物中選取重復性好、條帶清晰穩(wěn)定、信號強的38 對引物（表2），在300 份供試材料間進行PCR 反應[11]。

1.4 PCR 擴增及電泳檢測

PCR 反應體系為10 μL，包括1.0 μL 模板，正、反引物（5 μmol/L）各0.5 μL，5 μLTaqMasteMix（含有TaqDNA 聚合酶、PCR 緩沖液、Mg2+、dNTPs），3 μL ddH2O。擴增程序：95℃預變性2 min；94℃變性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸60 s，循環(huán)30 次；72℃延伸7 min；10℃保存。擴增產(chǎn)物在北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-6C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀上經(jīng)9%聚丙烯酰胺凝膠檢測，恒定電壓180 V，電泳1 h，銀染后觀察并照相[12-13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

對2 年田間數(shù)據(jù)進行平均值處理，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件對表型數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計描述分析，得到方差、標準差、變異系數(shù)等參數(shù)，并進行

聚類分析。對SSR 電泳圖譜上的條帶，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“2”[9,14]。用NTSYS-pc2.10e 軟件處理SSR 分型數(shù)據(jù)，計算品種對之間的遺傳相似系數(shù)，并獲得相似系數(shù)矩陣。用SHAN 程序中的UPGMA（Unweighted pair-group method with rithmetic averages）方法進行聚類分析，并通過Treeplot 模塊生成聚類圖。

表1 300份供試棉花材料

2 結果

2.1 300 份種質(zhì)的表型性狀遺傳多樣性方差分析

根據(jù)性狀調(diào)查結果，對300 份陸地棉種質(zhì)資源的生育期、單鈴重、株高、衣分、鈴數(shù)、皮棉產(chǎn)量、子棉產(chǎn)量、發(fā)病指數(shù)等產(chǎn)量性狀進行統(tǒng)計分析（表3）。上述8 個主要農(nóng)藝性狀中，300 份種質(zhì)資源的生育期、單鈴重、株高、衣分、鈴數(shù)、皮棉產(chǎn)量、子棉產(chǎn)量等性狀都有極顯著差異，只有發(fā)病指數(shù)不參與顯著性分析；鈴數(shù)、皮棉產(chǎn)量、子棉產(chǎn)量、發(fā)病指數(shù)等的變異系數(shù)很大，均超過20%；單鈴重的變異系數(shù)大于10%；生育期、衣分、株高的變異系數(shù)均低于10%；8 個表型性狀變異系數(shù)大小依次為發(fā)病指數(shù)＞皮棉產(chǎn)量＞鈴數(shù)＞單鈴重＞株高＞衣分＞子棉產(chǎn)量＞生育期；300 份種質(zhì)資源間的大部分表型性狀存在顯著差異，說明所選用的陸地棉種質(zhì)資源的表型性狀差異明顯、變異范圍大，具有比較好的代表性。對300 份棉花供試材料依據(jù)Shannon-Weaver 信息指數(shù)公式計算形態(tài)多樣性指數(shù)，從結果可以看出300 份供試材料的平均多樣性指數(shù)為5.597，8 個形態(tài)指標的多樣性指數(shù)依次為5.703、5.696、5.700、5.699、5.633、5.608、5.622、5.117，均表現(xiàn)出較高的多樣性；多樣性水平依次為生育期＞衣分＞株高＞單鈴重＞鈴數(shù)＞子棉產(chǎn)量＞皮棉產(chǎn)量＞發(fā)病指數(shù)。變異系數(shù)和Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)在表型性狀方面，2 個計算方法所得結果并不一致，這與前人的研究結果相同。原因可能是因為多樣性指數(shù)和變異系數(shù)的性質(zhì)以及計算方法不同。Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)強調(diào)的是不同層次分布的均勻度，而變異系數(shù)強調(diào)的是數(shù)值變異的大小。

2.2 300 份種質(zhì)的表型性狀聚類分析

表2 38 對多態(tài)性引物信息

表3 300份種質(zhì)資源表型性狀差異

利用SPSS19.0 軟件，根據(jù)調(diào)查的形態(tài)數(shù)據(jù)進行聚類分析，得到親緣關系聚類圖（圖1）。可以看出，300 份種質(zhì)資源被分為Ⅰ和Ⅱ兩大類，Ⅰ包括151 份品種，Ⅱ包括149 份品種。Ⅰ和Ⅱ又各自被分成Ⅰ-1、Ⅰ-2 和Ⅱ-1、Ⅱ-2，它們又分成Ⅰ-1-A、Ⅰ-1-B、Ⅰ-2-A、Ⅰ-2-B、Ⅱ-2-A、Ⅱ-2-B 等類別。

Ⅰ-1-A1 主要是一些抗蟲、抗黃萎病、中大鈴的優(yōu)質(zhì)品種，包括75、104、188、272、57、198、72、133、288、135、267 等46 份材料。

Ⅰ-1-A2 包括79、169、12、94、146、176、4、42、50、69、168、286 等27 份材料，該類群的特征不太統(tǒng)一，主要是色澤比較差的品種，還有一些高蛋白耐鹽優(yōu)質(zhì)品種、高抗黃萎病品種，如DES926；還有一個是國內(nèi)引進品種，紅桃。

Ⅰ-1-B1 包括148、268、144、278、172、237、242、256、277、128、56、250、282 等13 份材料，主要是一些創(chuàng)新種質(zhì)及OLD 品種，生育期比較長，鈴重居中，株高比較低，棉鈴蟲抗性較低。

Ⅰ-1-B2 包括183、293、190、255、35、187、129、232、260、67 等28 份材料。只有長德184、抗黃萎164 兩個品種抗蟲，其他均不抗蟲；生育期都很長，株高低。

Ⅰ-2-A 包括88、197、95、155、159、58、140、249、264、248、269 等17 份材料。株高偏低，均為不抗蟲品種。

Ⅰ-2-B1 包括283、284、36、231、234、139、161、38、292、285、296、280 等12 份材料，主要是一些豐產(chǎn)品種，不抗蟲，大部分為國外引進品種。

Ⅰ-2-B2 包括48、127、138、257、167、126、273、136 等8 份材料。產(chǎn)量很低，鈴數(shù)少，衣分低，不抗蟲。

Ⅱ-2-A 包括142、264、201、62、130、65、212、60、173、37、195、73 等20 份材料，個別抗蟲，整體生育期較長，矮桿，豐產(chǎn)。

Ⅱ-2-B1 包括218、241、131、238、253、30、177、243、270、281、107 等22 份材料。該亞類的特征是不抗蟲。

Ⅱ-2-B21 包括24、109、157、196、90、215、74、125、118、91、96、5、6 等34 份材料。該類群的品種大部分高產(chǎn)，株高偏低。

Ⅱ-2-B22 包括251、294、14、244、290、3、236、97、210、233、77、240 等32 份材料。衣分高，抗黃萎病指數(shù)比較高。

2.3 SSR 標記多態(tài)性分析

在篩選出的38 對引物中，共檢測出126 個等位位點，多態(tài)性位點為90 個，占71.43%，多態(tài)性比例較低。每個標記等位位點的數(shù)量范圍為2～10 個，平均3.66 個；每個標記的多態(tài)性位點為1～6個，平均2.42 個；引物JESPR291 擴增出的多態(tài)性條帶最多，為6 條，其次為引物NAU2679、NAU3888，均為5 條。

2.4 成對相似系數(shù)分析

利用NTSYS-pc2.10e 和Excel 軟件計算品種對間的遺傳相似系數(shù)，相似系數(shù)矩陣由于過大沒有列出，僅列出品種間的相似系數(shù)統(tǒng)計分析表（表4）。結果顯示，各品種對的相似系數(shù)為0.175～0.905，平均值0.533。遺傳差異較大（相似系數(shù)小于0.500）的品種對占46.31%，比例適中。46%品種對的遺傳相似系數(shù)較小，說明品種對之間的遺傳多樣性比較豐富。其中，M183 和M82 的遺傳相似系數(shù)最小，為0.175，遺傳差異最大；M101 和M81 的遺傳相似系數(shù)最大，為0.905，遺傳相似度極高。

2.5 SSR 標記的聚類分析

通過遺傳相似系數(shù)進行UPGMA 聚類（圖2），閾值為0.400 時，300 個品種被聚為Ⅰ和Ⅱ兩大類群。類群Ⅰ包括150 份種質(zhì)，閾值為0.590 時又被分為Ⅰ-1、Ⅰ-2 兩大類。Ⅰ-1 在閾值為0.616 時被分為兩類，Ⅰ-A 包括148 份種質(zhì)，遺傳相似系數(shù)為0.632～0900；Ⅰ-B 僅有1 份種質(zhì)蘇聯(lián)棉91系。Ⅰ-2 僅包括1 個品種博樂07-301。

Ⅰ-A 在閾值為0.65 時被分為9 個亞類。Ⅰ-A1 包括1、22、21、9、71 等68 份種質(zhì)，來源比較復雜，大部分為抗蟲品種，產(chǎn)量高。Ⅰ-A2 包括6、15、116、41、123 等24 份種質(zhì)，品種復雜，無明顯的共同特征，但大體上大部分均為抗蟲品種。Ⅰ-A3 只有庫車T94-6、魯農(nóng)9648 兩個品種。Ⅰ-A4 包括新陸早6 號、陜早2786、新陸棉201、徐州219、冀遠12-13，為OLD，不抗蟲品種。Ⅰ-A5 包括山農(nóng)豐抗6 號、R01/中三都4121 F9、宿9108/R03 F9。Ⅰ-A6 包括PD6186、新陸早38 號、中R1029、豫棉19、遼棉15 號、LA887/宿Bt F9、A41772BBt F7、中資9103、運93 抗393，豐產(chǎn)耐旱品種。Ⅰ-A7 包括時09、中1816、抗黃萎164、中R014121。Ⅰ-A8 包括Ari971、中RI015、CZA（70）33、中AR40772、TM1-IPR、中遠9115、L142-9、十五創(chuàng)新種質(zhì)，耐旱、耐鹽、抗蟲。Ⅰ-A9 包括6 份種質(zhì)，魯棉2 號、徐州514、A41772152 F6、14214612 F5、SGK 石選321、遼棉-5 號。

表4 相似系數(shù)統(tǒng)計分析

圖1 基于表型性狀的聚類圖

圖2 基于SSR 的聚類圖

類群Ⅱ包括150 個品種，閾值為0.594 時又被分為Ⅱ-1、Ⅱ-2 兩大類。Ⅱ-1 在遺傳相似系數(shù)為0.632 時被分為兩類，Ⅱ-A 包括136 個品種，遺傳相似系數(shù)變幅為0.635～0.891；Ⅱ-B 包括11 個品種，遺傳相似系數(shù)變幅為0.655～0.828。Ⅱ-2 包含3 個品種，分別為838、川棉-239、納上區(qū)大花，遺傳相似系數(shù)為0.638～0.683。

Ⅱ-A 又被分為8 個亞類。Ⅱ-A1 包括11 個品種，塔什干6 號、湘163、川R128、蘇BR6202Bt、J02-247、石抗278、澳B 資10、鄂沙28、泗長2 系、CS50、蘇農(nóng)6 號，大部分為創(chuàng)新種質(zhì)。Ⅱ-A2 包括豫284、中遠911、中G5。Ⅱ-A3 包括奎屯80-2056W、AcalaSJ-1-9、34 系、Miscot7803-52。Ⅱ-A4 包括永濟1 號、中31-204。Ⅱ-A5 包括229、285、296、298、186、277、279、292、248、234、297 等11 個品種，無鮮明特點。Ⅱ-A6 包括181、177、172、164 等28 個品種，大部分為創(chuàng)新種質(zhì)，豐產(chǎn)，來源較近。Ⅱ-A7 包括158、214、181、202、231 等45 個品種，大體上均抗蟲，豐產(chǎn)，抗黃萎病。Ⅱ-A8 包括180、281、190、212、154 等43 個品種，株高比較高，主要是一些具有不同特殊品質(zhì)的高蛋白、高酚等優(yōu)質(zhì)品種。

3 討論

前人大量研究表明，聚類分析結果與該試驗所選用的引物本身及引物數(shù)量有很大關系，考慮成本和效率的前提下，引物數(shù)量越多越好[15-17]。為了提高試驗的準確性，我們盡可能多地使用SSR 引物。篩選出的38 對多態(tài)性引物均已定位在棉花染色體上，如果這些引物能夠覆蓋全部連鎖群，試驗結果將會更加理想。

本試驗所篩選出的多態(tài)性引物數(shù)量比較少，多態(tài)性比率不高，很可能與采用隨機選取法選取16 個品種進行引物初篩有關，應選用地理來源或表型性狀差異較大的品種進行初篩。

表型性狀和SSR 分子標記分析均被應用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究，但2 種類型的分析結果各有側重。表型性狀調(diào)查結果是對觀測性狀的直接表現(xiàn)，而分子標記則揭示了個體在基因組水平上的基因結構之間的部分差異，只有將不同類型的數(shù)據(jù)結合起來使用，才能比較全面準確地闡明品種之間的遺傳關系[18-21]。

本試驗就將這2 種分析方式結合，通過分析可知，這2 種聚類結果既有一致的地方，也存在差異。例如，在2 種聚類結果中，總的大類聚類結果是一致的，43、26 和33 號等材料在表型聚類和分子標記聚類中被聚在同一類，類似的在2 種分類結果中得到相同聚類結果的材料所占比例很高。但是有些試驗材料在2 種聚類方法中卻表現(xiàn)出較大的差異，如1、109 號材料在形態(tài)性狀聚類中的親緣關系極近，但在SSR 分子標記聚類中卻被聚在了同一大類的2 個亞類。

總之，2 種方法在大的類群劃分上表現(xiàn)出比較好的一致性，但在類群內(nèi)的劃分出現(xiàn)了較大差異。這表明所選試驗材料之間的遺傳差異大小的變化，很可能會導致用遺傳相似系數(shù)與遺傳距離來確定的品種之間的遺傳差異的變化。分子標記從DNA 分子水平揭示的多樣性信息量大，更能比較真實地反映多態(tài)性的水平，本試驗表明了分子標記用于檢測遺傳多樣性的可靠性。在育種選種時，可以依據(jù)品種之間的遺傳相似系數(shù)的高低來選擇。但是，在實際中很難評定哪種聚類方法更好，要根據(jù)研究目的而定，對于以遺傳多樣性為基礎的核心種質(zhì)的構建來說，既要考慮基因型，又要考慮表現(xiàn)型，同時還要兼顧一些特異種質(zhì)資源，所以要多層面、多角度地分析研究，多種方法結合使用并相互印證，才能比較全面地了解種質(zhì)之間的親緣關系。

綜上，表型和SSR 聚類分析表明本實驗室保存的300 份棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性指數(shù)較高，表現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性，為培育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)早熟的棉花新品種提供了理論依據(jù)。