魯仕豪，石萍萍，2，王甜甜，吳軍，劉波

1.軍事醫(yī)學研究院生物工程研究所，北京100071；2.安徽大學物質科學與信息技術研究院，安徽合肥230000

近年來，生物技術藥物發(fā)展迅速，以單克隆抗體為首的重組生物制品在許多重大疾病的預防、診斷和治療中得到廣泛應用，是當今新藥研發(fā)的重點。目前已經(jīng)上市的單克隆抗體藥物都是使用哺乳動物細胞表達制備，如最常見的中國倉鼠卵巢細胞（CHO）、鼠雜交瘤細胞（NSO）等。但動物細胞生長緩慢，構建穩(wěn)定的工程細胞株所需時間長，且生產(chǎn)工藝放大和規(guī)模生產(chǎn)均存在一些瓶頸問題，難以滿足應對突發(fā)生物危害時，對防生抗體的快速、大量的需求。巴斯德畢赤酵母作為最簡單的真核生物，具有繁殖速度快、培養(yǎng)成本低、遺傳操作性強，并且作為真核生物具有一定的折疊加工和翻譯后修飾能力等特點，已經(jīng)被廣泛用于各類生物制品的表達和生產(chǎn)[1]。野生型畢赤酵母對重組蛋白的糖基化修飾與哺乳動物細胞復雜型糖鏈不同，是形成高甘露糖型蛋白。這類蛋白由于末端的甘露糖在體內容易被清除，導致半衰期縮短。并且高甘露糖型對生物學活性、抗體效應作用、藥代動力學和免疫原性都存在一定的影響，從而限制了畢赤酵母表達系統(tǒng)制備重組糖蛋白的應用。

本研究團隊構建的新型工程化畢赤酵母通過對N-糖基化修飾途徑的定向改造，順利阻斷了高甘露糖修飾，敲除和引入多種酶，使其具有類似于哺乳動物細胞復雜型糖基化修飾能力，為抗體等糖蛋白的制備提供了新的途徑[2-6]。本研究團隊使用糖基工程酵母系統(tǒng)表達制備重組單克隆抗體和疫苗項目正在進行中，目前已進入中試制備生產(chǎn)前階段。由于是國內首次利用畢赤酵母系統(tǒng)制備重組單克隆抗體，有針對性的臨床前質量控制研究資料極度缺乏。生物制品中殘余的宿主細胞的DNA 由于存在潛在致癌風險，一直以來都是非常重要的質量控制內容之一。針對宿主細胞DNA 殘余，2015 版《中華人民共和國藥典》三部中有明確規(guī)定：哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的產(chǎn)品中其含量不超過100 pg/劑量，酵母表達系統(tǒng)產(chǎn)品中其含量不得超過10 ng/劑量[7]。實時熒光定量PCR 自1993 年問世以來[8]，憑借著其特異性強、靈敏度高、污染少、快速便捷，逐漸應用于抗體外源DNA 殘余量的測定，能在一定程度上解決抗體外源DNA 殘余量測定的難題[9]，目前已經(jīng)逐步成為新藥報批質量控制中對宿主DNA 殘余檢測的主要技術之一，但藥典尚未公布基于工程化酵母表達重組蛋白的DNA 殘余的實時熒光定量PCR 檢測方法。

5S rRNA 基因在畢赤酵母中具有多達20 多個拷貝，廣泛分布于各染色體上，即使在基因組不完整的情況下也很容易被檢測到，適合作為DNA 殘余檢測的標志物。本研究通過對實時熒光定量PCR 方法的優(yōu)化，選擇畢赤酵母中的5S rRNA 作為檢測基因，完成了DNA 殘余檢測的方法學驗證，實現(xiàn)了對工程化酵母表達單克隆抗體原液中DNA 殘余量的高效、穩(wěn)定、高靈敏度的快速定量檢測，為工程化酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組生物制品的質量控制提供了新的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料

工程化酵母菌株制備的重組單克隆抗體（本研究室制備）；全自動熒光定量PCR 系統(tǒng)CFX Connect Real-Time System（美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司）；TB Green Premix Dimer Eraser（Perfect Real Time）、PCR 管（北京寶日醫(yī)生物技術有限公司）；酵母基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生物技術有限公司）；5S rRNA 基因特異性引物1（5′-GGTTGCGGCCATATCTAG-3′）和P2（5′-AGATTGCAGCACCTGAGT-3）（上海生工生物有限公司）[10-11]；NANODROP 2000 分光光度計（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 工程菌株基因組DNA 的提取

用酵母基因組DNA 提取試劑盒提取得到工程化菌株基因組DNA，用NANODROP 2000 測定基因組DNA 濃度及D260nm/D280nm值。

1.3 實時熒光定量PCR

將提取的工程化菌株的基因組DNA 用樣品緩沖液稀釋至不同濃度（1000、100、10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4pg/μL）作為標準品，每個濃度設置3 個平行樣品。反應體系包括TB Green Premix（2×）12.5 μL、引物（10 μmol/L）各0.75 μL、DNA 模板10 μL、無菌ddH2O 9.0 μL，共25.0 μL（dNTP、DNA 聚合酶、緩沖液等PCR 體系包含在商業(yè)化TB Green Premix 中）。按照商業(yè)化TB Green Premix 說明書推薦的三步法進行了部分優(yōu)化后的反應條件為：95℃模板預變性30 s，95℃變性5 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)70 次，65℃升至95℃時系統(tǒng)收集熒光信號，獲得單峰熔解曲線。

1.4 待測樣品處理方法

將工程化酵母表達的單克隆抗體原液用注射用生理鹽水稀釋至4.0 mg/mL，設置3 個平行樣品。為了防止高蛋白濃度對PCR 結果的影響，在此基礎上再增加一組1/10 稀釋，即0.4 mg/mL，同樣設置3 個平行樣品。

1.5 精密度和回收率測定

將100、1、1×10-2pg/μL 的標準品和高低濃度組供試品設置8 個平行對照，計算標準品和待測樣品的精密度。

設置標準品1、1×10-1、1×10-2pg/μL 濃度與待測樣品混合進行加樣回收實驗，設置3 個平行重復。用待測樣品稀釋1000 pg/μL 濃度的標準品分別至1、1×10-1、1×10-2pg/μL，采用下式計算回收率：回收率（%）=（標準品和樣品DNA 測定值-樣品測定值）/DNA 標準品理論值×100%

1.6 重組單克隆抗體原液中殘余DNA 含量測定

將測定的4.0 和0.4 mg/mL 單克隆抗體原液Ct 值（循環(huán)閾值）代入擬定的標準曲線，再根據(jù)回收率校正按下式計算DNA 殘余含量：樣品DNA 殘余量（pg/mg）=（樣品經(jīng)標準曲線計算濃度值×1000）/待測樣品蛋白濃度。

按照單抗人用注射劑量為20 mg/次，計算每人用劑量中宿主DNA 殘余量。

2 結果

2.1 工程菌株基因組DNA 提取結果

用NANODROP 2000 測定提取的工程化菌株基因組DNA 濃度，超純水作為空白對照，測得DNA 濃度為8.2 ng/μL，D260nm/D280nm值為1.79，在1.7～1.9 范圍內（純DNA 的D260nm/D280nm值為1.80）。

2.2 實時熒光定量PCR 檢測宿主DNA 殘余量標準曲線的建立

標準品DNA 濃度為1×10-3～1×104pg/μL 時擴增曲線光滑平穩(wěn)，峰值較高，3 個平行樣品的重復性較好，清晰區(qū)分了基線期、指數(shù)擴增期、平臺期，呈現(xiàn)出“S”型曲線，DNA 擴增效率高（圖1）。選取標準品DNA 濃度為1×10-3～1×103pg/μL 擬合標準曲線，以每個反應管內熒光信號達到設定閾值所經(jīng)歷的拷貝數(shù)Ct 值為縱坐標，樣品濃度取對數(shù)值為橫坐標，得到標準曲線的斜率為-3.174，截距28.92，擴增效率為1.22（圖2），樣品濃度x與循環(huán)閾值Ct 的線性關系表達式為Ct=-3.714x+28.92（x是DNA 標準品濃度取對數(shù)值）。圖3 為溫度從65℃升至95℃系統(tǒng)收集到的DNA 標準品的熔解曲線，可以看到所有標準品均呈現(xiàn)單一明顯的峰，無其他雜峰，說明反應特異性良好，無非特異性擴增和引物二聚體等干擾實驗結果。

圖1 標準品DNA 擴增曲線

圖2 循環(huán)閾值Ct 與DNA 標準品濃度的關系曲線

2.3 精密度測定結果

如表1，DNA 標準品濃度為100、1、1×10-2pg/μL 組的8 個平行樣品Ct 值的變異系數(shù)CV（%）分別為1.43、0.33、1.16，高、低濃度供試品8 個平行樣品Ct 值的變異系數(shù)CV（%）分別為2.86、2.62，說明該方法檢測的精密度高。

2.4 回收率測定結果

加樣回收率測定結果如表2，高濃度待測樣品組（4.0 mg/mL）的測定濃度與稀釋至1/10 后的低濃度待測樣品組的測定濃度相差不大，但加樣回收均偏差太大，說明高濃度蛋白的存在干擾了PCR 結果。低濃度待測樣品組的加樣回收率均為80%～120%。

圖3 DNA 標準品的熔解曲線

2.5 待測樣品中DNA 殘余量測定結果

根據(jù)儀器檢測待測樣品的Ct 值，代入標準曲線，再根據(jù)加樣回收測定結果，用加樣回收率校正結果的準確性。為避免高濃度蛋白對PCR 結果的影響，計算低濃度供試品（0.4 mg/mL）的宿主DNA 殘余量見表3，經(jīng)回收率校正后的平均值為0.049 pg/μL。如果按照單抗人用注射劑量為20 mg/次，換算成每劑量DNA 殘余量為2.45 ng，滿足藥典對于酵母系統(tǒng)產(chǎn)品宿主核酸殘余量不高于10 ng/劑量的要求。

3 討論

本研究團隊用糖基工程酵母制備的重組單克隆抗體是國內首次利用酵母系統(tǒng)制備重組單克隆抗體，急需建立相應的質控檢測方法學，推動中試和臨床前研究。

外源DNA 殘余量的測定多采用DNA 探針雜交法或熒光染色法[12-14]，這也是2015 版藥典中推薦的方法，但抗體制品用藥劑量大，人用劑量達到幾十甚至幾百毫克。由于存在高濃度蛋白的干擾[15]和實驗方法檢測限的限制，測定結果往往不太理想。實時熒光定量PCR 是在PCR 體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR 過程，最后通過特定數(shù)學原理對未知模板進行定量分析的方法。熒光信號的強弱與擴增產(chǎn)物量成正比，從而達到絕對定量的效果。相對于DNA 探針雜交法和熒光染色法，實時熒光定量PCR 法具有操作簡單、特異性好、自動化程度高等優(yōu)點。

表1 DNA標準品和待測樣品的精密度

表2 回收率測定結果

表3 低濃度待測樣品組的DNA殘余量

在這里我們優(yōu)化了引物設計、反應體系、反應條件、加樣回收實驗等，提高了PCR 反應的特異性，基本克服了方法學缺陷。標準品DNA 濃度為1×10-3～1×103pg/μL 時具有良好的線性關系（R2＞0.99），滿足微量DNA 殘余的檢測需求。利用本法測得人用重組單克隆抗體（畢赤酵母）原液中宿主DNA 殘余量為2.45 ng/劑量，低于10 ng/劑量的質量控制標準。優(yōu)化后的加樣回收實驗，DNA 標準品回收率控制在80%～120%，方法精密度良好，RSD 值≤5%。該方法檢測限達到1×10-3pg/μL，是一種靈敏度高、穩(wěn)定性好、簡便快速的檢測生物制品（畢赤酵母）中宿主DNA 殘余量的方法，適用于新藥研發(fā)的質量控制研究，具有較好的應用范圍和前景。