胡榮飛，陳璐瑤，張小妮，吳均堅，何文錦，陳由強，薛婷

福建師范大學a.生命科學學院海洋生物醫(yī)藥與制品產業(yè)化開發(fā)技術公共服務平臺；b.南方海洋研究院福建省微藻種質改良工程技術研究中心；福建福州350117

隨著基因編輯工具的發(fā)展，尤其是近年來CRISPR/Cas9 技術[1-2]的開發(fā)利用，傳統(tǒng)的DNA 提取方法已經無法滿足高通量的目的基因篩選工作。尤其對于細胞壁較厚的真核生物和一些非常規(guī)物種來說，提取DNA 需要進行大量摸索，不僅耗費試劑，更消耗了寶貴的時間。DNA 的提取無非是破除細胞壁使DNA 釋放出來，與傳統(tǒng)沸水浴、堿裂解、酶解法、反復凍融、液氮研磨不同的是，在本研究中，我們意圖更快速有效地破碎細胞壁來釋放DNA，因此采用研磨儀研磨的機械方法破碎細胞壁，使其中的DNA 釋放出來，以便用于目的基因快速擴增和基因組DNA 測序。研磨儀研磨法影響細胞破碎程度的因素主要有2 個，即研磨頻率和研磨時間。我們探究了研磨頻率和研磨時間的不同組合對DNA 提取效果的影響，建立了更好的DNA 提取方法。同時，用茂源鏈霉菌[3-5]、三角褐指藻[6-7]、釀酒酵母[8-9]驗證了該方法在不同物種中的可行性，以期建立一種全物種通用的快速提取基因組DNA 用于PCR 的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

茂源鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis）11019、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y1H（Leu2-）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）CCAP 1055/1 均為本實驗室保存；Biowest Regular Agarose G-10 購自上海生工公司；1.1× T3 Super PCR Mix 購自擎科生物技術有限公司；裂解緩沖液（1 mmol/L EDTA 2 mL，50 mmol/L 磷酸緩沖液250 mL，5% 甘油50 mL，加ddH2O 定容到1 L）；1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）。

研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；5424R 4℃離心機（Eppendorf 公司）；PCR 儀、梯度PCR 儀（Applied Biosystems 公司）；DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠）；ChemiDOCTMMP 凝膠成像儀（Bio-Rad 公司）。

1.2 引物與PCR 反應條件

引物見表1。反應條件：98℃2 min 預變性；98℃ 10 s 變性，Tm 60～65℃ 10 s 退火，72℃ 5～15 s/kb 延伸，32 個循環(huán)；72℃延伸2 min。擴增產物采用0.9%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3 用于PCR 的基因組快速提取

取適量樣品于2 mL EP 管中，加入2 顆滅菌的4 mm 鋼珠、100 μL 裂解緩沖液，放入研磨儀中研磨，研磨結束后將樣品放入70℃烘箱或水浴5 min，加入20 μL 1 mol/L 的Tris-HCl，上下顛倒幾次使混勻，13 000 r/min 離心3 min，取上清液直接作為模板用于PCR。若對PCR 的模板要求較高，也可用酚氯仿抽提后再進行PCR 實驗。

1.4 全基因組的快速提取

在超凈工作臺中取適量樣品放入液氮中冷凍，同時將液氮研磨管和研磨球一同放入液氮中快速冷凍，藥匙和2 mL EP 管也一同放入液氮中預冷備用。帶上防凍手套，用鑷子將樣品和研磨球放入液氮研磨管中旋緊，放入研磨儀中研磨。研磨結束后，用液氮預冷的藥匙取適量樣品粉末于2 mL EP 管中，加入400 μL 裂解緩沖液，于70℃烘箱或水浴5～10 min。加入80 μL 1 mol/L的Tris-HCl，上下顛倒幾次使其混勻。加入300 μL DNA 提取液（酚∶氯仿∶異戊醇為25∶24∶1），渦旋2 次，13 000 r/min 離心5 min。將上層水相吸到1.5 mL EP 管中，不要吸到下層有機相，大約吸300 μL 左右的水相。加入2～2.5 倍體積的無水乙醇或95%乙醇（預先在-20℃預冷沉淀效果更好），-20℃沉淀30 min。4℃，13 000 r/min 離心5 min 沉淀DNA，棄上清，沉淀即為DNA。用75%乙醇（-20℃預冷）清洗離心后的DNA，無需將DNA 混起，上下顛倒幾次，僅清洗表面即可。4℃下13 000 r/min 離心1～2 min，棄上清后在超凈工作臺中吹干或室溫揮發(fā)殘留的乙醇，用100 μL ddH2O 溶解。

表1 PCR擴增引物序列

1.5 提取條件的優(yōu)化

DNA 提取效果受研磨頻率和時間的影響。為確定快速提取DNA 的最優(yōu)條件，設計了不同的研磨頻率和研磨時間組合，見表2。

表2 不同研磨時間和頻率的組合

2 結果

2.1 最佳DNA 提取方法的確定

用研磨儀破碎細胞時，如果頻率過低，研磨力度不夠，導致細胞無法破碎，DNA 無法釋放出來；而頻率過高，則研磨力度過大，會將DNA 打碎，同時還會縮短研磨儀使用壽命。研磨時間過短，研磨不夠充分，DNA 也無法釋放出來；研磨時間過久也會打碎DNA，還會縮短研磨儀使用壽命。從實驗結果可以看出（圖1），當研磨頻率為40、50 Hz 時，研磨時間從2 min 增加到5 min 時，提取出來的DNA 在0.9%的瓊脂糖凝膠上無法看到任何條帶，這是由于研磨頻率太低，無法破碎細胞，導致DNA 無法釋放或釋放量極少。將這8個不同條件提取的無法看到條帶的DNA 進行PCR，卻發(fā)現(xiàn)可以得到SSTI 基因擴增條帶，說明該方法即使在很低的研磨頻率下，提取到的少量DNA 依然可以用于PCR 實驗。當研磨頻率達到60、70 Hz 時，研磨時間無論是2、3、4 還是5 min，提取出來的DNA 在0.9%的瓊脂糖凝膠上均可看到彌散的拖尾條帶，在相同研磨頻率下，隨著研磨時間的增加，DNA 條帶越亮；在相同的研磨時間下，隨著研磨頻率的增大，DNA 條帶也越亮。同樣利用這8 個條件下提取的DNA 進行PCR 擴增實驗，亦都能獲得SSTI 基因擴增條帶。

由此證明利用研磨儀破碎細胞提取DNA 用于PCR 完全可行，為了降低儀器的損耗和提高PCR 效果，后續(xù)實驗中選取的研磨頻率為60 Hz,研磨時間為2 min。

圖1 不同研磨頻率和時間下提取的DNA 電泳圖和PCR 電泳圖

2.2 全基因組的提取

為了滿足基因組測序以及重測序的要求，提取的基因組必須片段完整、純度高。因此，本實驗利用研磨儀結合液氮研磨法來提取茂源鏈霉菌的完整基因組DNA。機械研磨省去了手工研磨的費時費力，且研磨更加充分，液氮冷凍過的樣品很容易磨碎，因而實驗中只選取研磨頻率作為變量，選取的頻率為40、50、60、70 Hz，研磨時間固定為2 min。從實驗結果（圖2）可以看出，當研磨頻率為40 Hz 時就足以磨碎細胞壁，釋放出DNA，隨著研磨頻率的增大反而會打碎DNA，出現(xiàn)拖尾彌散甚至較小的DNA 條帶。為了提高DNA 的提取質量，降低儀器損耗，綜合考慮，用研磨儀液氮研磨樣品提取全基因組DNA 時，采用的頻率為40 Hz，研磨時間為2 min。

2.3 用于PCR 的基因組快速提取方法在不同物種中的驗證

2.3.1 在茂源鏈霉菌中的驗證 在用研磨儀快速破碎茂源鏈霉菌細胞后，我們選取了2 個基因片段（447 bp 的SSTI 基因和941 bp 的SSTI 基因加上游片段）對粗提的基因組進行PCR 實驗，以驗證該方法在霉菌中的可行性，結果選取的2 段目的基因均能從快速提取的茂源鏈霉菌基因組中擴增出來（圖3）。

圖2 茂源鏈霉菌全基因組DNA 提取的電泳結果

2.3.2 在三角褐指藻中的驗證 該方法可以在茂源鏈霉菌中成功進行目的基因的擴增，我們又將該方法應用于低等植物進行PCR 以驗證該方法的可行性。在用研磨儀破碎三角褐指藻粗提取基因組DNA 后，我們選取2 個目的基因片段（Δ5-fatty acid elongase 基因長936 bp，acetyl-CoA acyltransferase 基因長1374 bp）對粗提的基因組進行PCR 實驗，結果2 個目的基因片段均能從快速提取的三角褐指藻基因組中擴增出來（圖4）。

2.3.3 在釀酒酵母中的驗證 我們將該方法進一步應用到酵母中。選取釀酒酵母Y1H 作為實驗對象，用研磨儀破碎細胞粗提基因組后，同樣選取2 個目的片段（CYC1 基因長約300 bp，GPD1 基因加上下游共1577 bp）對粗提的基因組進行PCR，以驗證該方法在酵母中的可行性，結果見圖5，選取的2 個目的基因均能從粗提的基因組中擴增出目的片段。

2.4 用快速提取的基因組擴增較大的目的片段

基于快速提取的基因組在多個物種中實現(xiàn)目的基因擴增后，我們嘗試用該方法提取的基因組進行較大片段的擴增。選取茂源鏈霉菌中SSTI 基因上下游共4023 bp 的一段序列作為擴增的目的基因，結果見圖6，快速提取的基因組雖然被打碎，但對于較大片段的擴增仍是可行的。

圖3 茂源鏈霉菌基因組快速提取PCR 驗證結果

圖4 三角褐指藻基因組快速提取PCR 驗證結果

圖5 釀酒酵母Y1H 基因組快速提取PCR 驗證結果

圖6 茂源鏈霉菌中較大目的基因片段PCR 驗證結果

3 討論

在分子生物學研究領域，提取樣本DNA 是實驗的首要任務，目前已有很多成熟的方法[10-11]。DNA 提取的難點又在于怎樣更有效率地破除細胞壁，釋放里面的DNA，比較常用的方法有液氮研磨、酶解法、反復凍融、沸水浴、玻璃珠研磨、各種成品試劑等，但這些方法均須花費大量的時間、人力和物力，而且很難適用于多個不同樣品的一次性提取。在本實驗中，我們大膽嘗試將機械研磨應用于DNA 提取，對于僅用于PCR 的DNA提取，利用研磨儀可以同時提取64 個樣品，研磨時間2 min，加上水浴5 min、離心3 min，整個實驗流程下來只需10 min，即可輕松得到PCR 模板，而且實驗過程中無需使用有機溶劑，大大提高了DNA 的提取效率，同時也節(jié)約了大量時間，不使用有機溶劑更加環(huán)保健康，符合發(fā)展理念。對于需要測序的DNA 樣本，采用研磨儀液氮研磨，可在2 min 內磨好4 個樣品，相比于手工液氮研磨，不僅節(jié)約了時間，提高了實驗效率，而且研磨更加充分，同時也減少了因在研缽里研磨而造成的樣品損耗。在茂源鏈霉菌SSTI 基因敲除過程中，培養(yǎng)皿上長出無數轉化子，需要驗證目的基因是否被敲除以及敲除效率有多少。由于茂源鏈霉菌細胞壁較厚且結構緊密，沸水浴、堿裂解、反復凍融均無法達到快速提取基因組DNA 進行PCR 的目的，面對幾百個轉化子，如果用傳統(tǒng)的手工液氮研磨，再加上PCR 驗證，至少需要花費1 個月的時間，但采用研磨儀快速提取基因組進行PCR，僅在1 周內就完成了這個巨大的任務。

目前快速PCR 應用于山藥、人參等鑒別真?zhèn)螘r[12-13]，仍采用傳統(tǒng)方法提取總基因組后建立快速PCR，需要花費大量時間，與本實驗方法相比仍是繁瑣的，且針對單一物種，未在其他物種中驗證。王學仁等[14]建立的改進的DNA 提取方法，雖然可用于植物和真菌的DNA 提取，但仍只是在傳統(tǒng)方法上進行改進，所花費的時間精力相比于本實驗方法仍較多。陳吉良等[15]建立的高效快速提取病原真菌DNA 用于PCR 的方法，相對于傳統(tǒng)方法確實簡便很多，但還是需要手工液氮研磨，相比較本實驗方法的機械研磨無需手工、無需液氮，仍顯繁瑣。柴海云等[16]用自己配制的DNA 快速提取液可以直接裂解真菌，可用其作為PCR 模板，但有些細胞壁較厚的真菌無法用該方法提取出DNA，而本實驗采用研磨儀破碎細胞則不存在類似問題，只要研磨頻率夠高，再厚的細胞都可以破碎。孫立夫等[17]采用手電鉆在冰上研磨細胞，已達到破碎細胞快速提取DNA 的目的，但相比于本實驗中采用研磨儀研磨仍是效率低，不安全的。L?oke 等[18]也在酵母中建立了快速提取基因組DNA 用于PCR 的方法，方法足夠簡便，利用醋酸鋰和SDS 進行裂解細胞，水浴離心，無水乙醇抽提，但該方法僅在酵母中使用，很難適用于細胞壁較厚的非常規(guī)物種。

我們用研磨儀對茂源鏈霉菌進行研磨破碎，不僅建立了快速提取DNA 用于PCR 的方法，同時也建立了快速提取完整基因組DNA 的方法。以研磨儀快速提取的基因組DNA 為模板在茂源鏈霉菌中擴增目的基因取得成功后，又將該方法應用于三角褐指藻和釀酒酵母，并對同一物種中的2 個目的片段進行擴增，均取得成功。最后，利用快速提取的茂源鏈霉菌基因組DNA 對4023 bp 的大片段目的基因進行擴增，也成功擴增出目的條帶，這充分證明了利用研磨儀研磨提取DNA 進行PCR 的可行性。由于是機械研磨，所以不必考慮細胞壁的組成、厚度等問題，只要頻率夠高，足以磨碎所有的細胞，因此該方法可以推廣到更多的物種，為快速PCR 和提取完整基因組等試驗節(jié)約大量的人力物力。