穆巖，李麗麗，馬雙雙，宋月，王泉博*

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測試中心 a.環(huán)境與健康免疫研究室; b.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250014)

鉛污染及相關(guān)中毒事件是世界性環(huán)境和醫(yī)學(xué)問題。2017年，全球鉛生產(chǎn)量超過400萬噸，而中國是最大的鉛生產(chǎn)國和消費國[1-2]。相當一部分鉛通過電子垃圾、鉛基汽油、化妝品、含鉛涂料等不同形式污染自然環(huán)境，然后通過直接接觸，或食物鏈、PM 2.5等間接接觸方式進入人體[3]。研究表明，谷物、動物和人類體內(nèi)都已發(fā)現(xiàn)顯著的鉛積累。人體的鉛積累會導(dǎo)致嚴重的健康問題，包括肝損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害和炎癥等[4-5]，尤其兒童，鉛積累會引起神經(jīng)損傷和骨骼異常等不可逆的發(fā)育毒性[6]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，2016年有54萬人死于鉛中毒[7]。鉛一旦進入人體，則很難完全迅速排出，臨床對鉛中毒的治療主要是基于螯合療法，使用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉鈣)或二巰基琥珀酸等螯合劑治療[8-9]。然而，螯合療法主要應(yīng)用于高劑量的急性鉛中毒，對長期暴露而導(dǎo)致的微量鉛中毒作用有限。另一方面，螯合劑的使用也伴有嚴重的副作用，包括脫水、低血鈣和腎臟損害，甚至死亡[10-12]。

目前對鉛中毒的機制，主要研究其抑制體內(nèi)多種酶的活性和導(dǎo)致超氧化合物刺激等[13]，但鉛對神經(jīng)細胞代謝組學(xué)的影響研究較少。因此，本文以正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞BV-2為模型，采用UPLC-QTOF液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究鉛離子誘導(dǎo)下的BV-2細胞代謝組學(xué)變化，為鉛毒性緩解藥物的研發(fā)提供參考，為臨床鉛中毒的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

生物安全柜(上海力康生物科技有限公司)；倒置顯微鏡(美國奧林巴斯公司)；BSA124S分析天平(德國Sartorius公司)；超聲波清洗機(SB-3200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司)；流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；冷凍離心機(美國Thermo公司)；超高效液相色譜儀(Acquity H-Class，美國Waters公司)；四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(Impact Ⅱ，德國Bruker公司)。

1.2 試劑

色譜級甲醇、乙腈，購自美國Thermo公司；分析純甲酸、乙酸、碳酸氫銨、醋酸鉛，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；去離子水，美國Thermo公司純水機制備；細胞培養(yǎng)級胎牛血清，購自巴西Lonser公司；細胞培養(yǎng)級二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液、青霉素-鏈霉素溶液、細胞凋亡試劑盒，購自北京索萊寶有限公司；細胞培養(yǎng)級高糖DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基、溴化噻唑藍四氮唑，購自美國Sigma公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

使用添加10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細胞系BV-2，細胞培養(yǎng)箱溫度37 ℃，二氧化碳濃度5%。根據(jù)細胞生長密度，每2～3 d用細胞刮刀傳代培養(yǎng)。

2.2 醋酸鉛溶液的配制

取醋酸鉛粉末適量，精密稱定后溶解于對應(yīng)體積的純乙酸中，加入20倍體積去離子水稀釋制成儲備液，處理細胞時，按照0.1%比例加至培養(yǎng)基中暴露。

2.3 細胞形態(tài)學(xué)和增殖活力試驗

收集BV-2細胞懸液后，在400 g離心力下離心5 min，然后加入5 mL培養(yǎng)基重懸，測定細胞濃度；調(diào)整BV-2細胞濃度至按照1×105/mL，每孔100 μL接種于96孔板；細胞貼壁后分別加入1、10、20 μmol/L鉛離子(醋酸鉛溶液)或空白溶劑染毒暴露；處理48 h后，置于顯微鏡下拍照記錄細胞形態(tài)；然后加入MTT溶液，孵育4 h，加入二甲基亞砜溶解結(jié)晶后，在酶標儀495 nm波長下測定吸光度，以處理孔的吸光度與正常對照孔的吸光度比值計算細胞存活率。

2.4 細胞凋亡實驗

調(diào)整BV-2細胞濃度至1×105/mL，每皿3 mL接種于6 cm培養(yǎng)皿中，加入10 μmol/L鉛離子(醋酸鉛溶液)或相同體積的空白溶劑處理48 h。收集各組細胞后，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，然后用Annexin V-PE/7-AAD 染色20 min，放入BD流式細胞儀中進行細胞凋亡檢測和分析。

2.5 細胞代謝物提取

2.6 細胞代謝物液相及質(zhì)譜測定

超高效液相色譜儀參數(shù)為：Waters C18色譜柱(1.7 μmol/L，3.0 mm×100 mm)；柱溫40 ℃；樣品室溫度4 ℃；流速0.4 mL/min；洗脫溶劑為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)。洗脫梯度依次為0～2 min：99% A～A 70%；2～8 min：70% A～1% A；8～17 min：1% A；17.0～17.1 min：1% A～99% A；17.1～20.0 min：99% A；進樣量10 μL。

四極桿飛行時間質(zhì)譜儀參數(shù)為：離子源ESI；正離子模式；掃描質(zhì)荷比50～1500m/z；端板偏移電壓-500 V；毛細管電壓3.5 kV；霧化和干燥氣體為高純度氮氣，流速8.0 L/min，壓力2.0 bar；干燥溫度220 ℃。

2.7 細胞代謝物的液質(zhì)數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

將鉛離子暴露組和正常對照組所測全部液相和質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)，包括保留時間、離子流峰高及相應(yīng)離子片段分子量信息等，上傳至XCMS online數(shù)據(jù)庫[14]，選擇Pairwise模式進行數(shù)據(jù)處理，包括峰識別、特征峰提取、保留時間校正、特征峰對齊、自動t-test顯著性差異檢驗、主成分分析(principal component analysis，PCA)等。差異代謝物分析選擇P<0.05，變化倍數(shù)為1.5～40，分子量小于1000的特征峰。導(dǎo)出處理后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，上傳至MetaboAnalyst數(shù)據(jù)庫[15]，選擇Peaks to Pathway模式，進行代謝通路富集分析，設(shè)定參數(shù)如下：Mummichog算法，P<0.001，分子量比對精度0.000 5%，KEGG Mus musculus 代謝通路數(shù)據(jù)庫[16]。最終得到代謝通路富集圖及其相應(yīng)的差異代謝物。

2.8 數(shù)據(jù)分析

使用Graph pad prism 7.0軟件進行作圖，顯著性差異分析采用Student’s t-test，雙側(cè)檢驗，P<0.05視作具有顯著性差異。

3 試驗結(jié)果

3.1 鉛離子對神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)和數(shù)量的影響

如圖1所示，BV-2細胞在暴露不同濃度鉛離子48 h后，隨著鉛離子的濃度升高，在同等放大倍數(shù)和視野下的BV-2細胞數(shù)顯著減少，細胞形態(tài)由正常的多邊形略帶觸角變化為膨大的細長型，并伴有大量細胞碎片和膜塌陷的細胞圓球。整體看，鉛離子對細胞形態(tài)和數(shù)目的改變具有顯著的濃度依賴性，在10 μmol/L濃度下即產(chǎn)生顯著的毒性變化。

圖1 鉛離子對BV-2細胞形態(tài)的影響

3.2 鉛離子對神經(jīng)膠質(zhì)細胞存活率的影響

BV-2細胞存活率的測定采用MTT法進行。通過鉛離子暴露孔與正常對照孔的吸光度比值得出細胞存活率。結(jié)果如圖2所示，鉛離子處理BV-2細胞48 h后，相比正常對照組(空白溶劑處理)，1 μmol/L鉛離子暴露的細胞存活率沒有顯著性差異，而10 μmol/L鉛離子導(dǎo)致細胞存活率下降了40%左右，20 μmol/L鉛離子導(dǎo)致細胞存活率下降超過50%，說明鉛離子對神經(jīng)膠質(zhì)細胞的存活率具有顯著毒性，且具有濃度依賴性。

*代表與正常對照組(空白溶劑處理)相比，P<0.05

基于上述實驗結(jié)果可知，20 μmol/L高劑量鉛離子組細胞存活率嚴重降低，因此本文選擇10 μmol/L鉛離子暴露濃度進行進一步研究。

3.3 鉛離子對神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡的影響

對正常對照組與10 μmol/L鉛離子暴露組BV-2細胞的凋亡狀態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L鉛離子顯著增加BV-2細胞晚期凋亡或壞死比例，其從0.5%升高至6.1%；而細胞膜破損的細胞比例從2%增至12%(7-氨基放線菌素D陽性)，結(jié)果如圖3所示。實驗結(jié)果說明10 μmol/L鉛離子對神經(jīng)膠質(zhì)細胞具有明顯凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

圖3 鉛離子對BV-2細胞凋亡比例的影響

3.4 鉛離子對神經(jīng)膠質(zhì)細胞代謝物的影響

通過XCMS online數(shù)據(jù)庫對BV-2細胞正常對照組與10 μmol/L鉛離子暴露組的液相及質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果如圖4所示。由圖4a和4b可知，以離子峰高計，鉛離子對細胞總代謝物水平?jīng)]有產(chǎn)生顯著差異，各組6個樣品離子峰平行性良好。圖4c針對單個代謝物的數(shù)據(jù)分析顯示，兩組差異主要集中于10～12 min色譜區(qū)間，變化倍數(shù)大于1.5且具有顯著性差異(P<0.05)的特征峰數(shù)目為973個，圖中，氣泡個數(shù)代表差異特征峰，氣泡大小代表差異特征峰變化倍數(shù)大小，紅色代表鉛離子暴露組相應(yīng)代謝離子峰比正常對照組升高，綠色代表鉛離子暴露組相應(yīng)代謝離子峰比正常對照組下降。實驗說明，10 μmol/L鉛離子導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)生了顯著的代謝物的水平變化，顯著影響了細胞的生命過程。

圖4 正常對照組與鉛離子暴露組的BV-2細胞總離子流圖與差異代謝物可視化氣泡圖

3.5 神經(jīng)膠質(zhì)細胞正常對照組與鉛離子暴露組的PCA分析

通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，BV-2細胞正常對照組與10 μmol/L鉛離子暴露組具有明顯不同的聚類趨勢，以PC1(方差18%)特征為界限，正常對照組分布于左側(cè)區(qū)域而鉛離子暴露組全部分布于右側(cè)區(qū)域，組間表現(xiàn)出良好的分群特點。實驗顯示，作為外來污染物(刺激物)，鉛離子顯著改變了神經(jīng)膠質(zhì)細胞的代謝行為和模式，干擾了其正常代謝平衡和生理活動。詳見圖5。

圖5 BV-2細胞正常對照組與鉛離子暴露組的PCA得分圖

3.6 鉛離子對神經(jīng)膠質(zhì)細胞代謝通路的影響

將處理后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)上傳至MetaboAnalyst數(shù)據(jù)庫，設(shè)定P<0.001，將差異代謝物進行代謝通路富集分析，結(jié)果如圖6和表1所示，其中顯著程度由數(shù)據(jù)庫根據(jù)指定代謝通路的代謝物預(yù)期數(shù)量與實際測得數(shù)量的一致性情況計算得出，并以-logP值表示[15]。鉛離子顯著改變了代謝物谷氨酸、谷氨酰胺、多個葡糖糖代謝中間產(chǎn)物、3-羥基-3-甲基戊二酰乙酰輔酶A、乙酰輔酶A、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、谷胱甘肽等數(shù)十個代謝物水平，干擾了BV-2細胞中谷氨酰胺和谷氨酸鹽代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、丁酸鹽代謝以及谷胱甘肽代謝等多個涉及氧化還原功能等共33條重要代謝通路。根據(jù)圖6，越靠近右側(cè)，其權(quán)重值越高，越靠近上側(cè)，其顯著性越強。這些代謝通路大體可以分為以下3類：氨基酸和葡萄糖代謝通路、維持氧化還原狀態(tài)的代謝通路以及脂類代謝通路。

圖6 神經(jīng)膠質(zhì)細胞被鉛離子顯著改變的代謝通路富集圖

表1 鉛離子影響的BV-2神經(jīng)膠質(zhì)細胞的主要代謝通路及其代謝物

代謝通路分析結(jié)果提示，針對性地修復(fù)鉛離子造成的代謝通路紊亂可能會緩解其毒性，例如在受影響的谷胱甘肽代謝通路中，帶有活性巰基的谷胱甘肽和半胱氨酸的抗氧化和解毒作用，在維持細胞氧化還原平衡等生理活動中具有重要作用，可以使細胞膜免受過氧化耦合反應(yīng)，免于氧化應(yīng)激的損傷。有文獻報道天然產(chǎn)物槲皮素可以通過抑制氧化應(yīng)激減輕鉛離子造成的組織損傷[17]。

4 結(jié)論與討論

本文為了探索鉛離子生物毒性的細胞代謝組學(xué)作用機制，以神經(jīng)膠質(zhì)細胞為模型，對鉛離子導(dǎo)致的細胞形態(tài)變化、細胞存活率和凋亡等進行了研究，并基于UPLC-QTOF液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定了鉛離子暴露組和正常對照組的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中代謝物的水平。結(jié)果顯示，10 μmol/L 鉛離子即可引起神經(jīng)膠質(zhì)細胞的形態(tài)發(fā)生顯著變化、存活率下降以及凋亡比例的上升。這些結(jié)果與文獻[18]報道一致，表明鉛離子對神經(jīng)膠質(zhì)細胞具有顯著的生物毒性。與文獻[19]報道的正常腎細胞HEK293等細胞模型相比，本文發(fā)現(xiàn)BV-2細胞在10 μmol/L鉛離子暴露下存活率更低。進一步通過UPLC-QTOF質(zhì)譜測試發(fā)現(xiàn)，鉛離子暴露后的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中多達973個潛在代謝物水平變化大于1.5倍(P<0.05)，而且PCA分析顯示鉛離子暴露組和正常對照組BV-2細胞具有顯著不同的聚類趨勢，差異代謝物的通路富集分析顯示鉛離子顯著改變了神經(jīng)膠質(zhì)細胞中谷氨酰胺和谷氨酸鹽代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、丁酸鹽代謝以及谷胱甘肽代謝等多個涉及氧化還原等功能的重要代謝通路。這些結(jié)果表明鉛離子顯著影響了神經(jīng)膠質(zhì)細胞的代謝行為和模式，干擾了其正常代謝平衡和生理活動，這可能是鉛離子引起細胞毒性的作用機制之一。

綜上所述，鉛污染及其引起的中毒事件仍然是一個全球性問題，對鉛中毒尤其是低劑量鉛的毒性機制和治療需要進一步地深入研究，本文通過對鉛離子神經(jīng)膠質(zhì)細胞毒性和細胞代謝組學(xué)的研究，為鉛離子的毒性作用機制提供了理論參考，為緩解鉛毒性藥物研發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)。