不同初加工方法對(duì)延胡索5種生物堿含量的影響

劉珍珍 白橋 徐皓

摘要? ? 以延胡索藥材中5種生物堿的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)分析水煮、水蒸、醋煮和鹽煮4種初加工方法的效果。采用甲醇加熱回流法提取，采用高效液相色譜法檢測(cè)含量。以乙腈-0.01%磷酸水溶液為流動(dòng)相，按22∶78的比例進(jìn)行等度洗脫，流速1.0 mL/min，色譜柱（Inertsil ODS-3）溫度30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。結(jié)果表明，原阿片堿、延胡索乙素、掌葉防己堿、小檗堿、脫氫紫堇堿5種生物堿線性范圍分別為1.568～78.400、3.444～172.200、0.720～36.000、0.780～39.000、2.632～131.600 μg/mL（r≥0.999 3）;平均回收率（n=6）為94.89%、97.13%、102.39%、98.06%、100.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤2.10%;4種延胡索加工方法中有效成分含量由高到低依次為水蒸>水煮>醋煮>鹽煮，其中以蒸制5 min最佳。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高，可為延胡索產(chǎn)地初加工提供科學(xué)依據(jù)與技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞? ? 延胡索;產(chǎn)地加工;延胡索乙素;原阿片堿;掌葉防己堿;小檗堿;脫氫紫堇堿

中圖分類(lèi)號(hào)? ? R282.71? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）22-0173-04? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? Taking the contents of five alkaloids in Corydalis yanhusuo as an evaluation index to analyze the effects of four origin processing methods： boiled，steaming，vinegar boiled and salt boiled.Five alkaloids were extracted by methanol heating and refluxing，and the contents were determined by high performance liquid chromatography.The acetonitrile-0.01% phosphoric acid aqueous solution was used as the mobile phase，and the isocratic elution was carried out at a ratio of 22∶78，the flow rate was 1.0 mL/min，the temperature of the column（Inertsil ODS-3）was 30 ℃，and the detection wavelength was 283 nm.The results showed that the linear ranges of five alkaloids，such as protopine，tetrahydropalmatine，palmetine，berberine and dehydrocortino，were 1.568-78.400，3.444-172.200，0.720-36.000，0.780-39.000，2.632-131.600 μg/mL（r≥0.999 3）respectively;the average recovery（n=6）was 94.89%，97.13%，102.39%，98.06%，100.23%，relative standard deviation ≤2.10%;The active ingredients content from high to low was? steaming>boiled>vinegar boiled>salt boiled，which was the? best steamed for 5 min.The method is simple and accurate，and can provide scientific basis and technical support for the initial processing of the production area of Corydalis yanhusuo.

Key words? ? Corydalis yanhusuo;origin processing;tetrahydropalmatine;protopine;palmetine;berberine;dehydrocortino

延胡索為罌粟科（Papaveraceae sp.）紫堇屬（Corydalis DC.）植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）的干燥塊莖[1-6]，含多種生物堿，味辛、苦，性溫?！侗静菥V目》中記載延胡索有利氣、活血、止痛、通小便四大功效[7]，臨床多用于治療胸脅、跌撲腫痛、脘腹疼痛、產(chǎn)后瘀阻、經(jīng)閉痛經(jīng)等[5-6，8-11]。延胡索采挖后，不易儲(chǔ)存，傳統(tǒng)解決方法是煮制法，2015版藥典提供的加工標(biāo)準(zhǔn)為“煮至恰無(wú)白心”，但因煮制時(shí)間不明確，存在煮沸時(shí)間過(guò)短，達(dá)不到藥典標(biāo)準(zhǔn)，或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，出現(xiàn)有效成分流失的現(xiàn)象[11]，造成延胡索藥材質(zhì)量參差不齊[13-14]。

本文以5種生物堿的含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，用HPLC測(cè)定有效成分含量，篩選出適宜的產(chǎn)地初加工方法，旨在形成延胡索藥材產(chǎn)地初加工方法的標(biāo)準(zhǔn)，提高藥材品質(zhì)，并為其資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

供試材料為延胡索塊莖，于2017年3月初漢中城固縣董家營(yíng)村采挖。

試劑有對(duì)照品原阿片堿（批號(hào)Z26A7S13809）、延胡索乙素（批號(hào)Y21S7Y17091）、掌葉防己堿（批號(hào)W27S9Z71290）、小檗堿（批號(hào)Y31J9H67024）、脫氫紫堇堿（批號(hào)W13M8Z311 83），均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%;乙腈、甲醇、磷酸為色譜純;三乙胺，為分析純;超純水，加加糯米白醋（加加食品集團(tuán)股份有限公司）;精純鹽（四川樂(lè)山聯(lián)峰鹽化有限責(zé)任公司）。

試驗(yàn)儀器有Waters E2695高效液相色譜儀、FRQ-顯數(shù)小型超聲波清洗器（杭州法蘭特超聲波科技有限公司）、ESJ50-5電子天平（沈陽(yáng)神宇龍騰天平有限公司）、DHg-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上倉(cāng)精宏儀器設(shè)備有限公司）、CH22407微電腦電磁爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司）、UPH-I-5/10/20T優(yōu)普超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）、XL-08扣壓搖擺式小型粉碎機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）、DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋（上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司）、T-50津騰溶劑過(guò)濾器（北京卓信偉業(yè)科技有限公司）。

1.2? ? 試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 樣品制備。將延胡索洗凈，瀝干水分，按以下加工方法加工后烘干至含水量<15%，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

（1）水煮法。處理方法一：稱(chēng)取新鮮延胡索250 g，加水量為延胡索重量的1.5倍，分別在沸水中煮2、3、4、5、6 min。處理方法二：稱(chēng)取新鮮延胡索250 g，加水量為延胡索重量的1.5倍，在沸水中煮4 min，晾涼，于50、60、70、80 ℃下烘干。

（2）蒸制法。稱(chēng)取新鮮延胡索250 g，置于蒸制容器中，加熱至沸騰后，蒸制5、10、15、20、25 min。

（3）醋煮法。稱(chēng)取新鮮延胡索250 g，白醋與延胡索（mL/g）分別按照20∶100、30∶100、40∶100比例配制，加適量水，小火煮4、5、6 h。

（4）鹽煮法。稱(chēng)取新鮮延胡索250 g，鹽與延胡索（g/g）分別20∶100、30∶100、40∶100比例配制，加適量水，小火煮1.0、1.5、2.0 h。

1.2.2? ? 含量測(cè)定。

（1）色譜條件。色譜柱為Inertsil ODS-3（4.6×150 mm），檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm;流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸水溶液（含1.8 mL三乙胺），以流速1.0 mL/min，流動(dòng)相比例22∶78進(jìn)行等度洗脫;色譜柱溫度為30 ℃。

（2）混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備。精密稱(chēng)取原阿片堿3.92 mg、延胡索乙素8.61 mg、掌葉防己堿1.80 mg、小檗堿1.95 mg、脫氫紫堇堿6.58 mg用甲醇定容至25 mL容量瓶中，配制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

（3）線性關(guān)系。精密吸取0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，甲醇定容至10 mL量瓶中，得到一系列不同質(zhì)量濃度的生物堿混合對(duì)照品溶液，按上述試驗(yàn)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。以對(duì)照品的峰面積Y為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。

（4）供試品溶液的制備。精密稱(chēng)取0.5 g延胡索樣品，放置在250 mL平底燒瓶中，加入80%甲醇水溶液50 mL，稱(chēng)重，冷浸1 h，加熱回流1 h，冷卻至室溫，再次稱(chēng)定重量，用80%甲醇水溶液補(bǔ)足減少的重量，過(guò)濾，量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇水溶液溶解并定容至10 mL容量瓶?jī)?nèi)，搖勻，吸取適量溶液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，得到供試品溶液。平行制備試劑溶液3份，根據(jù)色譜檢測(cè)結(jié)果計(jì)算出樣品中生物堿的含量。

（5）專(zhuān)屬性試驗(yàn)。在上述試驗(yàn)色譜條件下，對(duì)混合對(duì)照品和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，制作色譜圖。

1.3? ? 方法學(xué)考察

1.3.1? ? 精密度試驗(yàn)。準(zhǔn)確吸取1.2.2（3）中制成的對(duì)照品溶液（0.5 mL混合對(duì)照品溶液定容至10 mL），重復(fù)進(jìn)樣6次，根據(jù)峰面積計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2? ? 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取水煮4 min，80 ℃烘干的延胡索樣品0.5 g，將制備好的供試品溶液放置0、4、8、12、16 h，根據(jù)樣品的峰面積計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.3? ? 重復(fù)性試驗(yàn)。平行制備6份供試品（水煮4 min，80 ℃烘干）溶液，根據(jù)樣品的峰面積計(jì)算其含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.4? ? 加樣回收率試驗(yàn)。平行制備6份已知含量的延胡索樣品（水煮4 min，80 ℃烘干），其中原阿片堿、延胡索乙素、掌葉防己堿、小檗堿、脫氫紫堇堿含量分別為439.98、1151.75、148.14、64.58、793.77 μg/g，每份樣品中加入質(zhì)量濃度分別為220.00、576.00、74.00、32.00、397.00 μg/mL的5種生物堿的混合對(duì)照品溶液1 mL，色譜檢測(cè)并計(jì)算其回收率。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 樣品含量色譜分析

線性回歸方程如表1所示，可以看出，5種生物堿的線性關(guān)系良好。樣品分析色譜圖如圖1所示，可以看出，5種生物堿均達(dá)到基線分離。

2.2? ? 不同加工方式對(duì)延胡索中5種生物堿含量的影響

2.2.1? ? 不同水煮時(shí)間對(duì)延胡索中5種生物堿含量的影響。如表2所示，隨著水煮時(shí)間的延長(zhǎng)總生物堿含量逐漸下降，但下降幅度不大，說(shuō)明在水煮過(guò)程中出現(xiàn)延胡索中有效成分流失的現(xiàn)象。因此，在達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)的前提下，應(yīng)盡可能縮短水煮時(shí)間。

2.2.2? ? 不同烘干溫度對(duì)延胡索中5種生物堿含量的影響。如表3所示，隨著烘干溫度的增長(zhǎng)總生物堿含量呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì);當(dāng)烘干溫度為80 ℃時(shí)，總生物堿含量最低，分析認(rèn)為高溫可能造成了部分生物堿的降解;當(dāng)烘干溫度為70 ℃時(shí)，不管是總生物堿含量，還是延胡索乙素含量都高于其他烘干溫度，因而認(rèn)為延胡索最佳烘干溫度為70 ℃。

2.2.3? ? 不同蒸制時(shí)間對(duì)延胡索中5種生物堿含量的影響。隨著蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)總生物堿含量呈小幅度下降趨勢(shì)，且蒸制處理后總生物堿含量和延胡索乙素含量都高于其他加工方法，蒸制5 min時(shí)總生物堿含量最高。與傳統(tǒng)加工方法相比，蒸制可減少延胡索與水的接觸，避免了有效成分的流失，最大限度地保留了藥材中的有效成分含量（表4）。

2.2.4? ? 不同醋煮處理對(duì)延胡索中5種生物堿含量的影響。如表5所示，不同醋煮處理導(dǎo)致總生物堿含量變化幅度較大;當(dāng)白醋∶延胡索（mL∶g）=40∶100、煮制4 h時(shí)總生物堿含量高于其他2個(gè)處理;當(dāng)白醋∶延胡索（mL∶g）=20∶100、煮制5 h時(shí)總生物堿的含量高于其他2個(gè)處理，當(dāng)白醋∶延胡索（mL∶g）=30∶100、煮制6 h時(shí)總生物堿含量高于其他2個(gè)處理，由此得出，白醋與延胡索的比例和生物堿含量之間沒(méi)有明確的關(guān)系。

2.2.5? ? 不同鹽煮處理對(duì)延胡索中5種生物堿含量的影響。如表6所示，不同鹽煮處理下，總生物堿含量變化幅度較小，由此得出鹽與延胡索的比例對(duì)延胡索總生物堿含量的影響較小。整體而言，鹽煮處理方法總生物堿含量低于其他幾種處理，不能最大程度地利用延胡索藥材。

綜合來(lái)看，延胡索最佳烘干溫度為70 ℃，在所有的加工方法中生物堿含量由高到低依次為水蒸、水煮、醋煮、鹽煮，其中以蒸制5 min最佳。醋煮、鹽煮2種方法煮制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致延胡索生物堿含量大幅度下降。由此得出，在延胡索加工處理中應(yīng)盡可能地縮短煮制時(shí)間，這對(duì)延胡索有效成分的保留具有重要作用。

2.3? ? 精密度試驗(yàn)

原阿片堿、延胡索乙素、掌葉防己堿、小檗堿、脫氫紫堇堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.79% 、0.76%、1.11%、0.96%、0.71%，表明儀器精密度良好。

2.4? ? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

原阿片堿、延胡索乙素、掌葉防己堿、小檗堿、脫氫紫堇堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.66%、1.21%、1.77%、1.13%、1.55%，表明16 h內(nèi)供試品溶液能保持較好的穩(wěn)定性。

2.5? ? 重復(fù)性試驗(yàn)

原阿片堿、延胡索乙素、掌葉防己堿、小檗堿、脫氫紫堇堿平均含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為439.98、1151.75、148.14、64.58、793.77 μg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.87%、1.22%、1.03%、1.13%、1.34%，表明該方法操作性強(qiáng)，重復(fù)性良好。

2.6? ? 加樣回收率試驗(yàn)

如表7所示，原阿片堿、延胡索乙素、掌葉防己堿、小檗堿、脫氫紫堇堿的平均回收率分別為94.89%、97.13%、102.39%、98.06%、100.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.87%、1.44%、2.10%、2.03%、1.69%。

3? ? 結(jié)論與討論

3.1? ? 提取方法和溶劑的選擇

通過(guò)查閱文獻(xiàn)，對(duì)超聲法、加熱回流法2種提取方式和水、乙醇、甲醇等不同提取溶劑進(jìn)行考察，以原阿片堿、掌葉防己堿、延胡索乙素、脫氫紫堇堿、小檗堿的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，甲醇加熱回流法效果最佳。進(jìn)一步對(duì)加熱回流提取法的提取溶劑比例100%、90%、80%、70%、60%甲醇水溶液，提取用量20、50、80 mL和回流提取時(shí)間30、60、90 min等因素進(jìn)行考察，結(jié)果表明，采用80% 甲醇水溶液50 mL回流提取60 min為最佳提取方法。

3.2? ? 色譜條件的選擇

洗脫條件考察了甲醇-磷酸、乙腈-磷酸系統(tǒng)，緩沖體系嘗試了磷酸-三乙胺、醋酸-三乙胺。按照15版《中國(guó)藥典》方法進(jìn)行洗脫[15]，各指標(biāo)成分不能完全分開(kāi)，最終以乙腈-0.01%磷酸水溶液（22∶78）系統(tǒng)下的峰形最佳，分離較好。因此，該條件可用于原阿片堿、延胡索乙素、掌葉防己堿、小檗堿和脫氫紫堇堿含量的測(cè)定。

3.3? ? 樣品含量分析

以5種生物堿含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較分析了延胡索4種產(chǎn)地初加工方法的效果，綜合得出以下結(jié)論：烘干溫度為70 ℃時(shí)，5種生物堿的含量略高于其他溫度處理，因而認(rèn)為延胡索最佳烘干溫度為70 ℃;在所有的加工方法中生物堿含量由高到低依次為水蒸、水煮、醋煮、鹽煮，其中以蒸制5 min最佳。蒸制可減少延胡索與水的接觸，避免有效成分的流失，因而藥材有效成分含量較高。

張麗宏等[16]研究認(rèn)為，延胡索的產(chǎn)地初加工方法中微波法優(yōu)于蒸制法和水煮法，任江劍等[17]研究認(rèn)為蒸制法優(yōu)于水煮法。但微波法不適于大批量處理，與生產(chǎn)實(shí)際不符。因此，研究結(jié)論與其他學(xué)者的結(jié)論一致。同時(shí)，大部分的加工方法[16]是對(duì)大小進(jìn)行分類(lèi)后的延胡索塊莖開(kāi)展研究，而實(shí)際采收后的塊莖大小不一致，分類(lèi)加工會(huì)增加成本和勞動(dòng)力，因而在延胡索塊莖加工時(shí)未進(jìn)行分類(lèi)處理，既可減少加工成本，又可節(jié)約人力，并能通過(guò)蒸制有效保證延胡索的質(zhì)量，可為延胡索藥材的產(chǎn)地加工標(biāo)準(zhǔn)與資源充分利用提供參考。

4? ? 參考文獻(xiàn)

[1] 陳東東，毛坤軍，李祥，等.HPLC法比較延胡索炮制前后7個(gè)生物堿成分的含量[J].藥物分析雜志，2015，35（9）：1591-1595.

[2] 蔣濛.醋制對(duì)延胡索主要活性成分含量及藥效學(xué)影響研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[3] 周曉龍.延胡索產(chǎn)銷(xiāo)分析[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2013，15（4）：340-341.

[4] 萬(wàn)莉，錢(qián)曉萍，劉寶瑞.延胡索生物堿化學(xué)成分及其抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].陜西腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20（5）：1042-1044.

[5] 張鐵軍，許浚，韓彥琪，等.中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）研究：延胡索質(zhì)量評(píng)價(jià)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中草藥，2016，47（9）：1458-1467.

[6] 張寶鑫.安中片中延胡索提取工藝的研究[J].黑龍江科技信息，2013（33）：16.

[7] 李時(shí)珍.本草綱目[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009.

[8] 馮靜.元胡生物堿成分及其在元胡止痛片質(zhì)量控制中的應(yīng)用研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[9] 林海，容穗華，高妮.優(yōu)選延胡索炮制方法[J].海峽藥學(xué)，2013，25（1）：37-40.

[10] 賈貝西.中藥延胡索質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化及制劑研究[D].開(kāi)封：河南大學(xué)，2008.

[11] 白沙沙.延胡索總堿緩釋滴丸的制備研究[D].天津：天津大學(xué)，2009.

[12] 王報(bào)捷，彭國(guó)維，廖九中，等.延胡索中原阿片堿提取工藝的研究[J].海峽藥學(xué)，2013，25（7）：36-38.

[13] 高普珠.影響延胡索產(chǎn)量質(zhì)量關(guān)鍵技術(shù)研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[14] 趙金娟，彭延弟，周建永，等.不同加工方法對(duì)金銀花質(zhì)量的影響（英文）[J].Agricultural Science &Technology，2015，16（4）：803-805.

[15] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[16] 張麗宏，游修琪，肖碧英，等.不同加工方法對(duì)延胡索質(zhì)量的影響[J].中成藥，2011，33（3）：471-476.