嘔吐毒素降解菌的篩選、鑒定及應(yīng)用

梁 含，馬召穩(wěn)，于思穎，李 旺

（河南科技大學動物科技學院，河南洛陽 471023）

嘔吐毒素學名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），是鐮刀菌屬的一種次級代謝產(chǎn)物，特別是禾谷鐮刀菌。DON 廣泛存在于大麥、小麥、玉米及燕麥等飼料原料和成品飼料中，DON 污染飼料是引起動物飼料中毒的重要原因[1-2]。我國的飼料原料及飼料成品中DON 污染特別嚴重，農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心在全國對飼料原料及配合飼料的檢測發(fā)現(xiàn)，2008—2014 年DON 的檢出率高達90% 左右，平均超標率為30%左右[3]。DON 可與核糖體60S 亞基的肽轉(zhuǎn)酶活性中心結(jié)合，觸發(fā)核糖體應(yīng)激反應(yīng)，抑制DNA、RNA 和蛋白合成，誘導(dǎo)細胞凋亡，破壞腸道、免疫系統(tǒng)，并且具有遺傳毒性，對動物健康產(chǎn)生嚴重影響，DON 是飼料中檢出率和超標率最高的一種真菌毒素[4]。有研究表明，豬對飼料中的DON 非常敏感，0.1～0.2 mg/kg 的劑量就會導(dǎo)致拒食和嘔吐，當攝入0.5 mg/kg DON 后，5～7 min 就會引起嘔吐拒食、生長能力下降及對傳染病的抵抗力下降[5]。中國《飼料衛(wèi)生標準》規(guī)定 DON 在豬配合飼料、犢牛配合飼料和泌乳期動物配合飼料中最高限量為≤1 mg/kg[6]。

DON 化學性質(zhì)很穩(wěn)定，具有很強的熱抵抗力，在加工、儲存及高溫高壓下很難對其毒性造成破壞。目前對DON 的降解方法主要有物理脫毒法、化學脫毒法和生物轉(zhuǎn)化法。物理脫毒主要采用霉菌毒素吸附法，包括黏土、硅鋁酸鹽、硅藻土、酯化甘露聚糖、葡甘露聚糖等。但霉菌毒素吸附劑對DON 的吸附效率太低，不足5%[7]?；瘜W反應(yīng)法是利用DON 在強堿、強酸等作用下會轉(zhuǎn)化成無毒物質(zhì)，但強堿、強酸和強氧化劑不僅會大大破壞飼料的口感和營養(yǎng)，也會帶來飼料的二次污染。與物理、化學脫毒方法相比，生物轉(zhuǎn)化法不會引入其他化學試劑的污染也不會造成原料營養(yǎng)的丟失[8]。由于生物轉(zhuǎn)化法具有高效、環(huán)保、針對性強等優(yōu)點，成為未來用于霉菌毒素脫毒的一種有效途徑。研究報道，已從多種樣品中（如土壤、受污染玉米、牛瘤胃液、雞腸道內(nèi)容物等）篩選到對DON 具有降解能力的菌株[9]，并對單菌的降解能力進行了研究。本試驗擬以多種培養(yǎng)基、不同的培養(yǎng)方式從不同類型的樣本中篩選對DON 降解能力高的新菌株，研究其降解DON 的能力，并根據(jù)微生物的協(xié)同作用將不同菌種組合應(yīng)用到飼料原料的脫毒處理中，得到能有效降解DON 的天然飼料菌種組合，為飼料中DON 的去除提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品 土壤、淤泥和發(fā)霉秸稈樣品采自河南科技大學；雞腸道內(nèi)容物、鯽魚腸道內(nèi)容物、牛瘤胃液、豬糞和牛糞等樣品采自河南周邊養(yǎng)殖場；自制發(fā)霉玉米和530 實驗室提供的發(fā)霉苜蓿樣品，共10 份。

1.1.2 主要試劑 DON 標準品購于天津一方科技有限公司，純度≥95.0%；向10 mg DON 標準品中加入10 mL滅菌水，放于4℃下保存、備用。DON 的ELISA 常規(guī)慢速檢測試劑盒購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）所需試劑購于TaKaRa 公司；細菌基因組抽提試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 酶標儀（Multiskan FC）、Bio-metro PCR 儀；高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、電泳槽、離心機、凝膠成像系統(tǒng)、顯微鏡、恒溫搖床等。

1.1.4 主要培養(yǎng)基 LB 固體培養(yǎng)基：酵母提取物 5 g，胰蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，瓊脂 15 g，加入 1 L 的無菌蒸餾水中，121℃高壓滅菌20 min。使用前加DON標準品使其終濃度為2 μg/mL。LB 液體培養(yǎng)基：除無瓊脂外，成分同LB 固體培養(yǎng)基。使用前加DON 標準品使其終濃度為1 μg/mL。

NA 固體培養(yǎng)基：10 g 蛋白胨，5 g NaCl，3 g 牛肉粉，瓊脂15 g，溶解于 1 000 mL 無菌蒸餾水中，121℃下滅菌20 min。使用前加DON 標準品使其終濃度為2 μg/mL。NA液體培養(yǎng)基：除無瓊脂外，成分同NA 固體培養(yǎng)基。使用前加DON 標準品使其終濃度為1 μg/mL。

MRS 固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，牛肉膏10 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，吐 溫1 g，K2HPO42 g，檸 檬 酸三胺2 g，乙酸鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。使用前加DON 標準品使其終濃度為2 μg/mL。MRS 液體培養(yǎng)基：除無瓊脂外，成分同MRS 固體培養(yǎng)基。使用前加DON 標準品使其終濃度為1 μg/mL。

1.1.5 引物 上海生工生物工程有限公司合成試驗中菌株16S rDNA 片段的擴增所需要的通用引物。上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3′，下游引物：5′-AAGGAGGTG ATCCAG CC-3′。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的處理 所采樣品各取1 g，每個樣品中加入10 mL 無菌水，充分震蕩得懸浮液，備用。

1.2.2 DON 降解菌株的初篩 取上述混懸液100 μL 分別涂布于含有DON 的3 種改良固體培養(yǎng)基中，好氧、厭氧2 種方式培養(yǎng)，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取在培養(yǎng)基上生長的形態(tài)不同的單菌落進行純培養(yǎng)。

1.2.3 DON 降解菌株的純化 將初篩得到的形態(tài)不同的單菌落劃線于新的與其相對應(yīng)的改良固體培養(yǎng)基平板上，如此反復(fù)劃線3～4 次以純化菌株。

1.2.4 DON 降解菌株的復(fù)篩 將上述經(jīng)過純化的菌株接種到含1 μg/mL DON 的改良液體培養(yǎng)基中，好氧菌在37℃、180 r/min 下培養(yǎng)直至菌液渾濁，厭氧菌靜置于37℃恒溫箱中。設(shè)置空白對照。用ELISA 測空白對照和菌液中DON 含量，對初篩菌種進行復(fù)篩，并保存降解能力強的DON 降解菌。

1.2.5 DON 降解菌的鑒定 形態(tài)學觀察：將通過復(fù)篩得到的菌株劃線接種于無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，在37℃下培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)、色澤和菌體特征。挑取新鮮的單菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體生理形態(tài)。

16S rDNA 序列分析鑒定：以25 μL 體系進行PCR擴增。由上海生工生物工程有限公司進行DNA 擴增的序列測定。將測序結(jié)果在GenBank 中進行BLAST 比對，對每個菌種選取15 個同源性在98%以上不同命名的菌株，下載這些菌株的16S rDNA 序列，用Mega 軟件構(gòu)建系統(tǒng)演化樹，比較菌種之間的親緣關(guān)系，確定其種屬。

PCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 2 min；變性94℃30 s，復(fù)性56℃ 30 s，延伸72℃ 1 min 30 s，35 個循環(huán)；終延伸72℃ 10 min，4℃保存。

PCR 反應(yīng)體系25 μL：上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，10×Ex TaqBuffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，模板（基因組DNA）1 μL，ExTaq 酶 0.5 μL，ddH2O 17 μL。

1.2.6 DON 降解菌的應(yīng)用 選擇LB01（枯草芽孢桿菌）、NA06（解淀粉芽孢桿菌）和MRS16（植物乳桿菌）作為發(fā)酵菌種，分別培養(yǎng)至6×109、2×109、3.5×109CFU/mL。通過菌種組合試驗設(shè)計接種于無機鹽液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過一系列單因素發(fā)酵試驗，確定發(fā)酵參數(shù)：發(fā)酵溫度37℃，10 mL 菌液或組合菌液（即單菌種10 mL、雙菌種組合各5 mL、三菌種組合各3.3 mL 以此類推）、40 mL無菌水加入到100 g 天然飼料麩皮中，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，以不加發(fā)酵液處理的為空白對照。分別于發(fā)酵48、72、96 h 時取樣，參照羅俊聰?shù)萚10]用ELISA 試劑盒檢測發(fā)酵麩皮中 DON 毒素含量，重復(fù)測定3 次取平均值。

1.2.7 DON 的測定及降解率 不同發(fā)酵處理的麩皮樣品分別在48、72、96 h 取樣，用ELISA 方法測定其DON 含量，DON 降解率=（空白組DON 含量－樣本組DON 含量）/空白組DON 含量×100%

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選 用3 種含有DON 的改良固體培養(yǎng)基以好氧和厭氧2 種方式共篩選到單菌落80 株。將這些菌株分離純化后接種含有DON 的改良液體培養(yǎng)基中，好氧菌在37℃、180 r/min 下培養(yǎng)直至菌液渾濁，厭氧菌靜置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，至底層菌體出現(xiàn)沉淀。用ELISA 測空白對照和菌液中DON 含量，得到16 株對DON 有降解能力的菌株，如表2 所示。根據(jù)培養(yǎng)基的不同進行編號，來自LB 培養(yǎng)基的編號為LB01、LB02、LB03、LB04；來自NA 培養(yǎng)基的編號為NA05、NA06、NA07、NA08、NA09；來 自MRS培養(yǎng)基的編號為MRS10、MRS11、MRS12、MRS13、MRS14、MRS15、MRS16。根據(jù)降解率的高低和培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式的不同選擇LB01、NA06 和MRS13 號菌株進行后續(xù)鑒定和應(yīng)用。

表1 不同菌株對DON 的降解率

2.2 菌株的形態(tài)學特征 如圖1 所示，所篩菌株中LB01號菌株菌落形態(tài)呈乳白色，不透明，表面干燥沒有光澤，中間褶皺邊緣不整齊；NA06 號菌株菌落呈白色不透明，有隆起，不透明，干燥，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則；MRS13 號菌株菌落呈乳白色半透明，菌落凸起邊緣整齊，表面濕潤且光滑，直徑在0.4～2.0 mm。

圖1 菌株的菌落形態(tài)

如圖2 所示，LB01 號菌株染色結(jié)果為陽性，在顯微鏡下觀察菌體呈長桿狀，兩端鈍圓，以成對或鏈狀排列，孢囊無明顯膨脹，無伴孢晶體。NA06 號菌株為革蘭氏陽性菌，長桿狀，有芽孢，有莢膜。MRS13 號菌株為革蘭氏陽性菌，在顯微鏡下觀察菌體呈短桿狀，且其菌體的排列方式有單個和鏈狀排列，無芽孢。

圖2 革蘭氏染色圖片

2.3 分子生物學鑒定 使用細菌基因組DNA 提取試劑盒從新鮮菌液中提取細菌基因組DNA，以菌株LB01、NA06、MRS13 的基因組DNA 為模板進行16S rDNA保守序列擴增。由圖3 可知，在1 000～2 000 bp 擴增到1 條特異性條帶，與細菌16S rDNA 大小相符。將擴增產(chǎn)物進行序列測定。序列測定結(jié)果進行BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比對。LB01 號與枯草芽孢桿菌菌株MSC46（KM222187.1）同源性最高達到99%。NA06 號菌株與解淀粉芽孢桿菌菌株EnBalf13（KP792638.1）同源性最高達到99%。MRS13 號菌株與植物乳桿菌菌株Sourdough-H04（MG754699.1）同源性最高達到99%。

圖3 菌株的 16S rDNA 片段 PCR 擴增結(jié)果

2.4 基于16S rDNA 序列的系統(tǒng)遺傳發(fā)育樹分析 由圖4 可知，LB01 號菌株與KM222187.1（枯草芽孢桿菌）親緣關(guān)系最近，結(jié)合其菌落特征、菌體特征和DNA 同源性比對結(jié)果，將LB01 號菌株確認為枯草芽孢桿菌。NA06 號菌株與KP792638.1（解淀粉芽孢桿菌）親緣關(guān)系最近，結(jié)合其菌落特征、菌體特征和DNA 同源性比對結(jié)果，將NA06 號菌株確認為解淀粉芽孢桿菌。MRS13 號菌株與MG754699.1（植物乳桿菌）親緣關(guān)系最近，結(jié)合其菌落特征、菌體特征和DNA 同源性比對結(jié)果，將MRS13 號菌株確認為植物乳桿菌。

2.5 菌株對麩皮中DON 毒素的降解 空白對照組DON含量為701.1 μg/kg。各樣品降解率結(jié)果如表2 所示，LB01 和MRS13 的組合對物料中DON 降解效果最好，在發(fā)酵48 h 時降解率最高達到71%。說明枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌在對DON 降解時具有一定的協(xié)同作用。

圖4 菌株的親緣關(guān)系

表2 組合菌種發(fā)酵對麩皮中DON 的降解

3 討 論

由于DON 給養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害巨大，物理、化學處理方法又各有缺點，故生物處理DON 成為研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，許多微生物如酵母菌、細菌、真菌等可以將DON 轉(zhuǎn)化為其他無毒或低毒物質(zhì)，達到去除或減少飼料中的霉菌毒素的目的[11]。譚劍等[12]從受污染的玉米中篩選到1 株能降解DON 菌株，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌。李曉鳳等[13]從土壤中篩選得到1 株能降解DON 的菌株，經(jīng)鑒定為發(fā)酵型腸桿菌。本試驗從土壤、淤泥、發(fā)霉玉米、腸道內(nèi)容物等樣品中篩選出16 株能夠降解DON 的菌株，其中從土壤樣品中篩選到2 株、淤泥樣品中3 株、雞腸道內(nèi)容物2 株、自制發(fā)霉玉米5株、牛糞2 株、豬糞和發(fā)霉秸稈分別為1 株，經(jīng)鑒定降解DON 的微生物菌種主要為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和植物乳桿菌，與上述文獻相符。

這些菌種對DON 的降解會隨著菌種不同和DON濃度、來源等出現(xiàn)較大變化。程亮等[14]篩選得到了1株假單胞桿菌，在 30℃與含有100 μg/mL 的 DON 無機鹽培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)14 d 后，降解率可達56.61%。徐劍宏等[11]分離出1 株德沃斯氏菌DDS-1，將其應(yīng)用到DON 濃度為25 μg/kg 的飼料中，菌株對DON 的降解率達到75.47%。微生物菌種可以通過自身代謝過程所產(chǎn)生的一系列物質(zhì)最終將DON 轉(zhuǎn)化成對人和動物無害的物質(zhì)。Garda-Buffon 等[15]研究報道，真菌類和乳酸菌類菌株對DON 主要是具有吸附作用。目前發(fā)現(xiàn)的微生物對DON 生物降解主要包括2 大類：腸道或瘤胃厭氧菌將DON 轉(zhuǎn)化為去環(huán)氧化合物DOM-1；好氧菌將DON 氧化成3-酮-DON，同時生成3-epi DON[16]。由此可以推測，本試驗對DON 降解最高的組合即枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌組合，對DON 的降解機理既有生物轉(zhuǎn)化作用，又有吸附作用。

本試驗以麩皮中的DON 作為降解對象，其含量和存在方式較標準液有很大區(qū)別。試驗所篩菌種在初篩和復(fù)篩時均是對DON 標準品的降解，但是在對麩皮中的天然DON 進行降解時差異很大。通過菌種的組合可提高DON 的降解率，說明枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和植物乳桿菌等菌種具有降解天然DON 的能力，不同菌種在對天然DON 降解時有協(xié)同作用。

4 結(jié) 論

本試驗中，初篩和復(fù)篩得到具有降解能力的菌株16 株，降解率最高達66.7%；選擇其中3 株，經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定，確定為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和植物乳桿菌；對其進行不同組合發(fā)酵麩皮，枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的組合對發(fā)酵麩皮中DON 的降解最高，在48 h 達71%。