添加劑對(duì)牛糞堆肥不同階段真菌群落演替的影響

葛勉慎,周海賓,沈玉君,孟海波,周 俊,董姍姍,李 冉,張 曦,程紅勝,王 健

添加劑對(duì)牛糞堆肥不同階段真菌群落演替的影響

葛勉慎1,2,周海賓2,沈玉君2,孟海波2,周 俊1*,董姍姍2,李 冉2,張 曦2,程紅勝2,王 健2

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211816；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院農(nóng)村能源與環(huán)保研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部資源循環(huán)利用技術(shù)與模式重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100125)

為研究物理添加劑對(duì)牛糞堆肥過(guò)程中真菌群落結(jié)構(gòu)的影響,以牛糞和小麥秸稈為原料,以生物炭、火山石作為添加劑,進(jìn)行了為期30d的堆肥實(shí)驗(yàn).結(jié)果表明,好氧發(fā)酵基本實(shí)現(xiàn)牛糞無(wú)害化和穩(wěn)定化的要求.高通量測(cè)序結(jié)果顯示,堆肥原料中占主導(dǎo)地位,相對(duì)豐度達(dá)到86.85%;堆肥高溫階段,空白處理和火山石處理中、為優(yōu)勢(shì)菌屬,而生物炭處理中、相對(duì)豐度較高;降溫階段,和占優(yōu)勢(shì),添加生物炭的處理中的相對(duì)豐度較其他兩個(gè)處理高.腐熟階段,3個(gè)處理中的相對(duì)豐度均為最高,而火山石的添加增加了及的相對(duì)豐度.Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明,牛糞堆肥過(guò)程中與GI、TN、TP、NH4+-N、含水率、pH值、VS、脲酶顯著相關(guān)(<0.05).本研究從真菌變化的角度,為牛糞好氧發(fā)酵機(jī)理研究與工藝優(yōu)化提供參考.

牛糞堆肥；生物炭；火山石；真菌；群落結(jié)構(gòu)

近年來(lái),規(guī)?；B(yǎng)殖快速發(fā)展,產(chǎn)生了大量的畜禽糞污,明顯增加了環(huán)境的負(fù)擔(dān).據(jù)測(cè)算[1],我國(guó)畜禽糞污年產(chǎn)生量38億t,其中牛場(chǎng)糞污產(chǎn)量達(dá)到13.8億t.牛糞中含有大量的氮、磷、鉀以及有機(jī)質(zhì)組分,具有很高的肥料化利用潛力.然而,一些規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的糞污未經(jīng)處理隨意排放或不當(dāng)利用,造成了嚴(yán)重的水體?空氣污染.好氧堆肥是牛糞處理的主推技術(shù)之一,發(fā)酵處理后的產(chǎn)物可為農(nóng)作物生長(zhǎng)提供養(yǎng)分物質(zhì),同時(shí)還可以改善土壤理化性質(zhì)[2].目前,牛糞好氧發(fā)酵技術(shù)仍然存在腐熟度不高、無(wú)害化不徹底等問(wèn)題,未發(fā)酵完全的產(chǎn)品施用于土壤易引起植物毒性[3],因此開(kāi)展牛糞堆肥腐熟的研究迫在眉睫.

堆肥的本質(zhì)是在好氧條件下由多種微生物共同作用,通過(guò)將難分解的有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定腐殖質(zhì)的動(dòng)態(tài)過(guò)程[4].對(duì)堆肥過(guò)程中微生物群落動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究將有助于提高堆肥效率[5].近年來(lái),研究人員采用多種方法對(duì)好氧堆肥過(guò)程中的微生物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌的平均生成時(shí)間比真菌短得多[6],這使它們?cè)诙逊蔬^(guò)程中具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),因此目前的研究大多集中在細(xì)菌的群落演替,而對(duì)堆肥中真菌的關(guān)注較少.有報(bào)道稱,堆肥過(guò)程中細(xì)菌起主要作用,溫度的顯著上升會(huì)使真菌難以生存[7],但Lopez- Gonzalez等[8]認(rèn)為真菌也對(duì)牛糞堆肥的順利進(jìn)行起重要作用.此外,多項(xiàng)研究[9-10]表明部分真菌可以耐受高溫,整個(gè)堆肥過(guò)程是在細(xì)菌和真菌共同作用下進(jìn)行的[11].

一些研究人員通過(guò)外源添加劑改變物料理化特性及堆體結(jié)構(gòu),優(yōu)化微生物生長(zhǎng)環(huán)境,從而實(shí)現(xiàn)堆肥品質(zhì)的有效提升.近年來(lái),生物炭作為一種廉價(jià)、高效、穩(wěn)定的添加劑,由于其良好的吸附性能、較大的比表面積[12]以及豐富的表面官能團(tuán)[13]等優(yōu)勢(shì),被廣泛用于堆肥過(guò)程以提高產(chǎn)品質(zhì)量.Sanchez- Monedero等[14]發(fā)現(xiàn)生物炭作為有機(jī)廢棄物堆肥添加劑能夠更多地保留植物養(yǎng)分以及縮短堆肥時(shí)間.張海濱等[15]研究結(jié)果表明,在沼渣堆肥中添加生物炭可以促進(jìn)真菌生長(zhǎng).Steiner等[16]研究指出家禽(肉雞)垃圾與20%的生物炭聯(lián)用相比于直接堆肥氨排放降低64%、總氮損失減少52%.由此可見(jiàn),生物炭的添加對(duì)堆肥腐熟進(jìn)程有利[17].火山石同樣作為一種大比表面積、高吸附性能的材料[18],在堆肥中的應(yīng)用也有報(bào)道[19],且與生物炭相比價(jià)格更低,更易獲取.現(xiàn)階段,添加劑在堆肥過(guò)程中的研究主要集中于對(duì)比堆肥效果,并未對(duì)好氧發(fā)酵的機(jī)理進(jìn)行深層次分析,且不同物理添加劑對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道仍然不多.

本實(shí)驗(yàn)研究了添加生物炭、火山石對(duì)牛糞堆肥腐熟以及真菌群落演替的影響.通過(guò)測(cè)定堆肥典型階段的指標(biāo)判斷堆肥腐熟,利用高通量測(cè)序技術(shù)分析堆肥過(guò)程中真菌群落結(jié)構(gòu)的變化及其與多種因子之間的關(guān)系,以期為牛糞好氧發(fā)酵工藝優(yōu)化及有機(jī)肥品質(zhì)提升提供指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

本研究采用的牛糞取自河北省三河市某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng).采用的調(diào)理劑為小麥秸稈,取自北京市大興區(qū)某農(nóng)村,粉碎至1~2cm,實(shí)驗(yàn)原料的基礎(chǔ)理化性質(zhì)見(jiàn)表1.生物炭為玉米芯粉碎并烘干,置于管式爐中550℃下碳化2h制得,火山石購(gòu)置于河北智睿礦產(chǎn)品加工有限公司,粒徑為1~3mm,主要成分為SiO2.

表1 原料的基礎(chǔ)性質(zhì)

實(shí)驗(yàn)于2018年8~10月于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院雙橋院區(qū)內(nèi)進(jìn)行.堆肥物料為18kg牛糞鮮樣與3kg粉碎后的風(fēng)干小麥秸稈,分別加入0.45kg的生物炭、火山石,以未加入添加劑的堆肥為對(duì)照處理.添加劑處理組噴灑去離子水將混合物料的含水率調(diào)節(jié)至65%左右,以保證3個(gè)處理初始含水率保持一致.物料混合均勻后置于60L好氧發(fā)酵裝置中(圖1)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn).好氧發(fā)酵裝置由發(fā)酵罐罐體、溫度計(jì)探頭、電腦、鼓風(fēng)機(jī)等部分組成,堆體上、中、下層設(shè)置溫度傳感器與電腦記錄儀聯(lián)接,實(shí)時(shí)記錄堆體溫度.曝氣參數(shù)設(shè)置為曝氣5min間隔45min,通風(fēng)量控制在15L/min,于發(fā)酵第11,22d(兩次均為堆體溫度降到室溫后)進(jìn)行翻堆操作.

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)處理:空白處理(CK):牛糞+秸稈;生物炭處理(B):牛糞+秸稈+生物炭;火山石處理(V):牛糞+秸稈+火山石.

圖1 堆肥裝置示意

1.發(fā)酵罐罐體2.溫度探頭 3.排氣口4.電腦5.鼓風(fēng)機(jī) 6.流量計(jì) 7.采樣口 8.篩網(wǎng)9.滲濾液排出口

1.2 樣品采集及分析

在堆肥第0d(混合物料)、第1d(高溫階段)、第15d(降溫階段)、第30d(腐熟階段)取樣,分別于堆體上、中、下層取樣共300g左右,充分混合均勻后分為3份:一份立即用于測(cè)定酶活性;一份儲(chǔ)存于4℃的冰箱內(nèi)用于理化指標(biāo)的測(cè)定;第三份儲(chǔ)存于超低溫冰箱中用于真菌群落分析.

溫度由傳感器(SBWZ-2460,上海虹天)與電腦連接,實(shí)時(shí)記錄(最終結(jié)果為上、中、下層溫度加權(quán)計(jì)算).將混合均勻的樣品置于105℃的烘箱中烘干至恒重,計(jì)算得到樣品含水率.pH值、電導(dǎo)率[20]是將新鮮樣品與去離子水按固液比1:10充分振蕩并靜置后,用pH計(jì)(FE28,上海梅特勒-托利多)和電導(dǎo)率儀(DDS-307A,上海精科雷磁)測(cè)得.揮發(fā)性固體采用恒重法:將烘干后的樣品置于550℃的馬弗爐中灼燒至恒重進(jìn)行計(jì)算.牛糞、秸稈原料的總碳、總氮采用元素分析儀(PE2400,美國(guó)PerkinElmer)測(cè)定,堆肥過(guò)程中TN采用凱氏定氮法、TP采用堿熔法,銨態(tài)氮、硝酸鹽氮分別采用靛酚藍(lán)比色法和酚二磺酸比色法.脲酶的測(cè)定參考文獻(xiàn)[21]的方法,在樣品中加入尿素,37℃下培養(yǎng)1d,測(cè)定氨的生成量表征酶活性,酶活性單位為mg/(g·d).

發(fā)芽指數(shù)(GI)的測(cè)定[22]:將新鮮樣品與蒸餾水以固液比1:10混合,室溫振蕩1h后過(guò)濾,取濾液5mL加入到直徑9cm并放有一片濾紙和20個(gè)飽滿油菜種子的培養(yǎng)皿中,置于25℃培養(yǎng)箱中,于黑暗條件下培養(yǎng)3d.以去離子水為對(duì)照,每個(gè)樣品重復(fù)3次,種子發(fā)芽指數(shù)GI(%)由公式(1)計(jì)算:

1.3 高通量測(cè)序

使用Magnetic Soil And Stool DNA Kit (TIANGEN,北京)提取堆肥樣品的總DNA,利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),檢測(cè)電壓為5V,電泳時(shí)間20min.通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增真菌總DNA-ITS序列.所用引物為ITS1F(5'-CTTGGTC- ATTTAGAGGAAGTAA-3')/ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3').20μLPCR擴(kuò)增體系:10ng Template DNA,2mL 10xbuffer,2mL 2.5mmol/L dNTPs, 0.2mL rTaq Polymerase,引物各0.8mL,0.2mL BSA,補(bǔ)ddH2O至20mL.擴(kuò)增條件為:高溫(95℃)變性3min; 95℃變性30s,55℃退火30s, 72℃延伸45s循環(huán)35次;72℃延伸10min,最終維持在10℃直至停止.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),取3mL上樣.純化后的PCR產(chǎn)物濃度大于10ng/mL,OD260/ 280≈1.8.最終產(chǎn)物于Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序.

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始測(cè)序序列通過(guò)Trimmomatic軟件質(zhì)控,使用FLASH軟件進(jìn)行拼接.采用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/),根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類,并在聚類的過(guò)程中去除單序列和嵌合體.典型對(duì)應(yīng)分析:采用計(jì)算機(jī)R語(yǔ)言vegan包進(jìn)行CCA分析.利用R(pheatmap package)軟件進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析.采用origin2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 堆肥過(guò)程中溫度的變化

圖2 堆肥過(guò)程中溫度的變化

溫度是決定微生物種群相對(duì)優(yōu)勢(shì)的一個(gè)重要因素[23],可作為評(píng)價(jià)堆肥效果的主要參考指標(biāo)[24].3個(gè)處理的堆體溫度均在24h內(nèi)迅速上升并達(dá)到最大值(分別為63.5,63.16,66.19℃),且保持溫度在50℃以上超過(guò)5d,符合國(guó)家糞便無(wú)害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[25].隨著高溫期的維持以及有機(jī)物的消耗,微生物代謝活動(dòng)減慢,產(chǎn)熱量少,3個(gè)堆體溫度開(kāi)始下降.在堆肥第2~3d,空白處理組溫度略高于添加劑處理組,這可能與生物炭、火山石的添加增加了物料孔隙度,從而加速了堆體中的熱量散失有關(guān).隨著好氧發(fā)酵進(jìn)行,火山石處理組的溫度相對(duì)較低,而生物炭處理的溫度一直處于較高水平[26].此外,由圖2可以看出,在堆肥第11,22d進(jìn)行翻堆后,各處理的堆體溫度相對(duì)于前一天均有不同程度的上升,但火山石處理上升趨勢(shì)并不明顯,可能是火山石處理中物料發(fā)酵比較完全所致.

2.2 不同添加劑對(duì)堆肥腐熟的影響

堆肥腐熟不能僅通過(guò)單一的指標(biāo)來(lái)判斷,需要結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)參數(shù)來(lái)綜合評(píng)價(jià)[27].堆肥過(guò)程中不同階段物料理化、腐熟指標(biāo)如表2所示.EC反映樣品中可溶性鹽的含量,可溶性鹽含量過(guò)高會(huì)抑制作物生長(zhǎng)[28],整個(gè)過(guò)程中3個(gè)處理的EC值均未超過(guò)4mS/cm[29].堆肥產(chǎn)品的含水率分別為49.51%、51.10%、52.23%.整個(gè)過(guò)程中pH值的變化不明顯,且在發(fā)酵過(guò)程中一直處于較高水平,最終產(chǎn)品的pH值分別為9.59、9.62、9.53,高于有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)[30]中規(guī)定的限值.VS與樣品中有機(jī)質(zhì)的含量相關(guān),VS數(shù)據(jù)顯示初始階段有機(jī)物質(zhì)含量較高,隨著堆肥的進(jìn)行,大分子有機(jī)物質(zhì)的消耗,VS逐漸降低.TN、TP是堆肥過(guò)程中的養(yǎng)分指標(biāo),3個(gè)處理腐熟物料中TN相比初始物料分別增加了78.92%、44.32%、39.46%,TP增加了89.06%、54.91%、27.46%.由文獻(xiàn)[31]可知,堆肥腐熟產(chǎn)品中NH4+-N濃度應(yīng)小于400mg/kg,3組堆肥產(chǎn)品均符合要求.腐熟階段NH4+-N濃度相比于高溫階段有很大程度降低,但NO3--N在腐熟階段的增加量并不明顯.此外,由表2的數(shù)據(jù)可知,堆肥腐熟樣品中添加劑處理的TN、NH4+-N、NO3--N均低于空白處理,這可能是由于物料pH值較高以及生物炭、火山石添加改善了物料的結(jié)構(gòu),氣相部分遷移速率較快使得堆體內(nèi)氮素以NH3的形式損失過(guò)多造成的[32].脲酶的變化與堆肥過(guò)程中氮元素的轉(zhuǎn)化密切相關(guān),可促進(jìn)尿素酰胺鍵的水解從而產(chǎn)生氨和CO2[33],添加劑處理組脲酶活性在腐熟階段高于空白處理.

GI是評(píng)價(jià)堆肥腐熟最常用的指標(biāo),一般認(rèn)為GI達(dá)到50%的樣品用于土壤即不會(huì)對(duì)作物產(chǎn)生毒害作用[34],當(dāng)達(dá)到80%~85%以上時(shí)[35],即可認(rèn)為堆肥腐熟.3個(gè)處理最終產(chǎn)品的GI值分別為87.29%、94.96%以及86.77%,均符合堆肥腐熟要求.以上的分析結(jié)果表明,3個(gè)處理牛糞堆肥產(chǎn)品達(dá)到腐熟標(biāo)準(zhǔn),且生物炭處理腐熟程度更高,但從氮素保留的角度來(lái)看,物理添加劑可能不適合pH值相對(duì)較高的牛糞堆肥.

表2 堆肥過(guò)程中不同階段樣品理化、腐熟指標(biāo)

注:D0代表混合物料,D1、D15、D30分別代表堆肥的高溫階段、降溫階段、腐熟階段,下同.

2.3 真菌群落的演變

2.3.1 不同添加劑對(duì)真菌豐度和多樣性的影響 通過(guò)樣品的Alpha多樣性分析可以研究群落生態(tài)學(xué)的微生物多樣性[36],常用的指標(biāo)包括Coverage、ACE、Chao、Shannon以及Simpson指數(shù).Coverage指數(shù)反映樣品中基因序列被檢測(cè)出來(lái)的覆蓋率.由表3可知,堆肥階段各個(gè)樣品的Coverage指數(shù)都達(dá)到了0.99以上,表明測(cè)序結(jié)果可以很好地反映樣品的真實(shí)情況[37].Chao和ACE指數(shù)常用來(lái)估算樣本實(shí)際OTU數(shù)目從而反映真菌群落豐度.由表3的結(jié)果可知,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,CK、B處理中高溫階段的ACE、Chao指數(shù)均明顯低于初始混料,這可能是0~1d溫度迅速上升使部分真菌不能適應(yīng)劇烈環(huán)境溫度的變化而死亡所致[38].V處理中真菌群落豐度在發(fā)酵各階段均高于B處理和CK處理,可見(jiàn)V處理可以提高堆肥過(guò)程中真菌的群落豐度,而生物炭的添加僅降溫階段(相對(duì)于CK)提高了真菌群落豐度.Shannon、Simpson指數(shù)可以反映群落分布多樣性,用于描述堆肥中物種分布規(guī)律[39].Shannon指數(shù)值越大,說(shuō)明群落多樣性越高,而Simpson指數(shù)值越大,群落多樣性越低.3個(gè)處理都在高溫階段群落分布多樣性最高,其中V和CK處理真菌豐度相差不大,Shannon指數(shù)的值分別為2.581和2.502,明顯高于初始混料(1.560).然而,B處理Shannon指數(shù)的值在高溫階段為僅1.398,低于CK且呈下降的趨勢(shì),這與Du等[26]在研究生物炭對(duì)堆肥細(xì)菌群落多樣性的影響中得出結(jié)果類似.在堆肥的降溫階段,B處理和V處理的Shannon指數(shù)值分別為1.319和1.296,高于空白處理(1.003),說(shuō)明降溫階段的添加劑處理組真菌多樣性較高,這與Simpson指數(shù)表現(xiàn)出的規(guī)律一致.

表3 堆肥樣品中真菌群落多樣性指數(shù)

2.3.2 不同添加劑對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響 真菌群落結(jié)構(gòu)的變化反映了不同添加劑對(duì)堆肥進(jìn)程的復(fù)雜影響.在門水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)如圖3(a)所示.初始物料中Basidiomycota的相對(duì)豐度最高,達(dá)到87.08%,其次為Ascomycota、unclassified-k-Fungi分別占了9.06%和3.85%.隨著發(fā)酵的進(jìn)行,樣品中的真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化.高溫階段,3個(gè)處理的Ascomycota的相對(duì)豐度分別增加到46.17%、97.65%、54.97%,逐漸成為優(yōu)勢(shì)群落[40],且在降溫階段和腐熟階段一直保持在90%以上,這與Gu等[41]在雞糞堆肥過(guò)程中的研究結(jié)果類似.B處理在高溫階段與CK、V處理差異明顯,生物炭的添加促進(jìn)了Ascomycota相對(duì)豐度的迅速增加.

屬水平上的各個(gè)樣品的群落結(jié)構(gòu)如圖3(b)所示,初始物料中為優(yōu)勢(shì)菌屬(相對(duì)豐度為86.85%),占6.98%,而幾乎未檢測(cè)到(0.01%).隨著發(fā)酵進(jìn)行到高溫階段,溫度迅速上升使得各個(gè)處理的群落結(jié)構(gòu)相比于混料階段發(fā)生了明顯的變化,CK、V處理的分別上升至37.09%、47.78%,且在高溫階段逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌屬[42].B處理真菌群落結(jié)構(gòu)與其他兩個(gè)處理明顯不同,生物炭的添加使得和的相對(duì)豐度顯著提升至56.83%、30.36%,另外還檢測(cè)到4.86%的,這3種菌屬成為B處理中相對(duì)豐度前3的主要菌屬.總體上看,生物炭對(duì)牛糞堆肥過(guò)程中真菌群落結(jié)構(gòu)的影響主要集中在高溫階段.3個(gè)處理中真菌群落結(jié)構(gòu)在堆肥降溫階段的變化相似,和成為優(yōu)勢(shì)菌屬,生物炭的添加在一定程度上增加了的相對(duì)豐度.Zhang等[43]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌與纖維素的降解密切相關(guān),而、等真菌菌屬與半纖維素的降解有關(guān).高溫階段分解半纖維素的真菌主要為,而主要在降溫階段起主要作用,因此,火山石、生物炭的添加對(duì)牛糞堆肥過(guò)程中不同階段的半纖維素的降解有促進(jìn)作用.在腐熟階段,CK處理與B處理中相對(duì)豐度依舊占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(相對(duì)豐度分別為81.21%、94.21%),而V處理中的相對(duì)豐度僅為47.77%,另外,、的相對(duì)豐度分別上升到35.33%、7.83%(之前各處理含量極低),這可能與火山石本身的特性有關(guān).Wang等[10]人在研究為期60d的牛糞堆肥中真菌群落結(jié)構(gòu)變化過(guò)程中同樣發(fā)現(xiàn),的相對(duì)豐度在第10d,30d達(dá)到90%以上.是牛糞好氧發(fā)酵降溫階段和腐熟階段的優(yōu)勢(shì)菌群,可通過(guò)產(chǎn)生多種水解酶[44]分解高溫期后剩余的大分子物質(zhì)為堆肥后期提供能量,因此推測(cè)為判斷牛糞堆肥腐熟的典型菌屬,生物炭的添加在腐熟階段對(duì)堆肥腐殖化進(jìn)程有利.

2.3.3 堆肥過(guò)程中真菌群落與理化指標(biāo)的典型對(duì)應(yīng)分析 真菌群落結(jié)構(gòu)除了受外源添加劑的影響外,堆肥過(guò)程中理化因子的變化也會(huì)對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[45].為了確定不同堆肥處理真菌群落組成與理化因子之間的關(guān)系,將各樣本和環(huán)境因子進(jìn)行了典型對(duì)應(yīng)分析(CCA).由圖4可知,CCA前兩個(gè)排序軸共解釋了69.91%的樣本信息,說(shuō)明堆肥過(guò)程中真菌群落的變化與選擇的環(huán)境因子有關(guān).CK、V處理在高溫階段與混合物料真菌群落結(jié)構(gòu)相近,而B(niǎo)處理在此階段與CK、V處理差異明顯;發(fā)酵進(jìn)入降溫階段,B處理與CK、V處理的真菌群落結(jié)構(gòu)差異逐漸減小;進(jìn)入腐熟階段后,CK與B處理真菌群落結(jié)構(gòu)極為相似,而V處理與它們差異較大,這與屬水平的群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律一致.時(shí)紅蕾等[46]的研究同樣發(fā)現(xiàn)微生物群落在堆肥溫度上升期變化較大,而后期趨于穩(wěn)定.總體來(lái)看,堆肥過(guò)程中真菌群落結(jié)構(gòu)的變化主要發(fā)生在高溫階段,而降溫及腐熟階段的真菌群落結(jié)構(gòu)逐漸趨同.

a:; b:; c: unclassified-; d:; e:; f:; g:; h:; i: unclassified-; j:

CCA分析結(jié)果表明,含水率、VS、溫度以及NH4+-N與高溫階段的樣本密切相關(guān),其中含水率對(duì)CK、V處理的樣本影響明顯,而NH4+-N與高溫階段B處理群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較大,結(jié)合表2的數(shù)據(jù)來(lái)看,生物炭的添加在高溫階段增加了堆體內(nèi)NH4+-N的含量,改善了和的生長(zhǎng)環(huán)境,使其在此階段相對(duì)豐度明顯增加.絕大多數(shù)降溫階段及腐熟階段的樣本聚在一起,TN和pH值為影響此階段樣本群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子,且TN和pH值與、以及菌屬相關(guān)性較大.從CCA分析排序圖中可見(jiàn),環(huán)境因子對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)影響的相關(guān)性大小依次為:TN>NH4+-N>含水率>VS>pH值>溫度>TP>EC>NO3--N,前6個(gè)環(huán)境因子對(duì)真菌群落的演替有顯著影響(<0.05),其中TN更是達(dá)到了極顯著水平(<0.01).

2.3.4 堆肥過(guò)程中真菌群落與理化、腐熟指標(biāo)的相關(guān)性分析 對(duì)環(huán)境因子、腐熟指標(biāo)與堆肥過(guò)程中屬水平上豐度前10的菌屬進(jìn)行了Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果如圖5所示.與GI、TN、TP和pH值呈顯著正相關(guān)(<0.05),但與含水率、VS、脲酶和NH4+-N呈顯著負(fù)相關(guān).與的規(guī)律相反,它與GI、TN、TP和pH值呈顯著負(fù)相關(guān),但與含水率、VS、脲酶和NH4+-N呈顯著正相關(guān).作為一種耐熱真菌,與堆肥過(guò)程中養(yǎng)分指標(biāo)(TN、TP)及腐熟指標(biāo)(GI)呈極顯著正相關(guān),且可以通過(guò)分解耐熱的水解酶來(lái)分解有機(jī)物[47],因此推測(cè)對(duì)堆肥的“正向”進(jìn)行起關(guān)鍵作用.由文獻(xiàn)可知,為農(nóng)業(yè)環(huán)境中可致人患病的半知菌,能夠產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物[48].另外,與堆肥過(guò)程中TN、TP以及GI呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān),結(jié)合真菌群落結(jié)構(gòu)的內(nèi)容來(lái)看,它的存在可能對(duì)堆肥進(jìn)程產(chǎn)生不利影響,好氧發(fā)酵產(chǎn)生的高溫可明顯抑制其生長(zhǎng).

Tortosa等[49]的研究結(jié)果表明,腐熟過(guò)程中相對(duì)序列數(shù)量增加,且與研究的大多數(shù)堆肥參數(shù)相關(guān)性最好的菌屬可以作為判斷堆肥腐熟的生物標(biāo)志.在本研究中,屬水平上的真菌相對(duì)豐度顯示,在混合物料和高溫階段幾乎未檢測(cè)到(相對(duì)豐度<1%),而到腐熟階段CK、B處理中的相對(duì)豐度分別上升到81.21%、94.21%,雖然V處理中的相對(duì)豐度相僅為47.77%,但依舊是最優(yōu)勢(shì)的菌屬.此外,與多數(shù)指標(biāo)(GI、TN、TP、含水率、pH值、VS、NH4+-N、脲酶)顯著相關(guān),因此推斷可以作為牛糞、小麥秸稈堆肥腐熟的真菌生物標(biāo)志.這與張文浩等[50]在牛糞稻稈堆肥中得到的可作為堆肥腐熟的真菌標(biāo)志的結(jié)論存在差異,可能是堆肥周期不同所致.

圖5 豐度前10的菌屬與堆肥過(guò)程中多種指標(biāo)Spearman相關(guān)性分析熱圖(n=10)

*代表<0.05; **代表<0.01;***代表<0.001的顯著性檢驗(yàn)水平

3 結(jié)論

3.1 3個(gè)處理的牛糞好氧堆肥均達(dá)到腐熟要求,生物炭的添加提高了堆肥產(chǎn)品的腐熟度,但火山石的影響不明顯.

3.2 火山石的添加可以提高堆肥各階段真菌群落豐度和多樣性,生物炭?jī)H在降溫階段對(duì)真菌群落豐度和多樣性有利.

3.3 生物炭、火山石分別在高溫階段、腐熟階段對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響.其中添加生物炭提高了堆肥高溫階段、的相對(duì)豐度,而火山石使、的相對(duì)豐度在腐熟階段明顯增加.

3.4 添加劑通過(guò)改變環(huán)境因子進(jìn)而對(duì)牛糞堆肥過(guò)程中真菌群落的演替產(chǎn)生顯著影響.CCA分析結(jié)果表明,NH4+-N、含水率、VS以及溫度在堆肥前期(高溫階段)對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大,而TN和pH值對(duì)堆肥后期(降溫、腐熟階段)的真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大.

3.5 綜合真菌群落結(jié)構(gòu)以及Spearman相關(guān)性分析的結(jié)果,可推斷作為牛糞堆肥腐熟的真菌生物標(biāo)志.

[1] 張 鶴,李孟嬋,楊慧珍,等.不同碳氮比對(duì)牛糞好氧堆肥腐熟過(guò)程的影響[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2019,54(1):60-67.Zhang H, Li M C, Yang H Z, et al. Effect of different carbon and nitrogen ratio on decayed process of aerobic composting of cow dung [J]. Journal of Gansu Agricultural University, 2019,54(1):60-67.

[2] Guo R, Li G, Jiang T, et al. Effect of aeration rate, C/N ratio and moisture content on the stability and maturity of compost [J]. Bioresource Technology, 2012,112:171-178.

[3] Butler T A, Sikora L J, Steinhilber P M, et al. Compost age and sample storage effects on maturity indicators of biosolids compost [J]. Journal of Environmental Quality, 2001,30(6):2141-2148.

[4] Lopez-Gonzalez J A, Suarez-Estrella F, Vargas-Garcia M C, et al. Dynamics of bacterial microbiota during lignocellulosic waste composting: Studies upon its structure, functionality and biodiversity [J]. Bioresource Technology, 2015,175:406-416.

[5] Brown S, Kruger C, Subler S. Greenhouse gas balance for composting operations [J]. Journal of Environmental Quality, 2008,37(4):1396- 1410.

[6] Ryckeboer J, Mergaert J, Vaes K,et al. A survey of bacteria and fungi occurring during composting and self-heating processes [J]. Annals of Microbiology, 2003,53(4):349-410.

[7] Miller FC. Composting of municipal solid waste and its components [M]. Boca Raton: CRC Press, 1996.

[8] López-González J A, del Carmen Vargas-García M, López M J, et al. Biodiversity and succession of mycobiota associated to agricultural lignocellulosic waste-based composting [J]. Bioresource Technology, 2015,187:305-313.

[9] Seb?k F, Dobolyi C, Bobvos J, et al. Thermophilic fungi in air samples in surroundings of compost piles of municipal, agricultural and horticultural origin [J]. Aerobiologia, 2016,32(2):255-263.

[10] Wang K, Yin X, Mao H, et al. Changes in structure and function of fungal community in cow manure composting [J]. Bioresource Technology, 2018,255:123-130.

[11] Partanen P, Hultman J, Paulin L, et al. Bacterial diversity at different stages of the composting process [J]. BMC microbiology, 2010,10(1): 10-94.

[12] Wang Q, Li R, Cai H, et al. Improving pig manure composting efficiency employing Ca-bentonite [J]. Ecological Engineering, 2016,87:157-161.

[13] 王彤彤,王曉琳,任志勝,等.不同原料制備的生物炭形貌結(jié)構(gòu)及表面特性研究[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2017,40(1):42-48. Wang T T, Wang X L, Ren Z S, et al. Microscopic morphology and surface features of biochars derived from different raw materials [J]. Environmental Science & Technology, 2017,40(1):42-48.

[14] Sanchez-Monedero M, Cayuela M, Roig A, et al. Role of biochar as an additive in organic waste composting [J]. Bioresource Technology, 2018,247:1155-1164.

[15] 張海濱,孟海波,沈玉君,等.生物炭對(duì)沼渣堆肥理化性狀及微生物種群變化的影響 [J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2019,25(2):245-253. Zhang H B, Meng H B, Shen Y J, et al. Effect of biochar addition on physicochemical properties and microbialpopulation of biogas residue compost [J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizers, 2019,25(2): 245-253.

[16] Steiner C, Das K, Melear N, et al. Reducing nitrogen loss during poultry litter composting using biochar [J]. Journal of Environmental Quality, 2010,39(4):1236-1242.

[17] 劉 立,張朝升,趙美花.生物炭對(duì)好氧堆肥化處理影響的研究進(jìn)展 [J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2018,41(9):170-175. Liu L, Zhang C S, Zhao M H. Impacts of biochar on aerobic composting:a review [J]. Environmental Science & Technology, 2018, 41(9):170-175.

[18] 聶 鳳,熊正為,黃建洪,等.改性火山石-PAC復(fù)合絮凝劑處理城鎮(zhèn)生活污水試驗(yàn)研究 [J]. 水處理技術(shù), 2012,38(4):87-90. Nie F, Xiong Z W, Huang J H, et al. Treatment of municipal dometic sewage by compound flocculent of modified vesuvianite-pac [J]. Technologyof Water Treatment, 2012,38(4):87- 90.

[19] Wu C, Li W, Wang K, et al. Usage of pumice as bulking agent in sewage sludge composting [J]. Bioresource Technology, 2015,190: 516-521.

[20] 杜龍龍,袁 京,李國(guó)學(xué),等.通風(fēng)速率對(duì)廚余垃圾堆肥NH3和H2S排放及腐熟度影響 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2015,35(12):3714-3720. Du L L, Yuan J, Li G X, et al. Effect of aeration rate on the NH3and H2S emissions and maturity of kitchen waste composting [J]. China Environmental Science, 2015,35(12):3714-3720.

[21] 關(guān)松蔭.土壤酶及其研究法[M]. 北京:農(nóng)業(yè)出版社, 1986:294-297. Guan S Y. Study method of soil enzyme [M]. Beijing:Agriculture Publishing House, 1986:294-297.

[22] Zucconi F. Biological evaluation of compost maturity [J]. Biocycle, 1981,22(4):27-29.

[23] Takii K I M F S. Microbial succession during a composting process as evaluated by denaturing gradient gel electrophoresis analysis [J]. Journal of Applied Microbiology, 2000,89(5):768-777.

[24] Zheng G, Chen T, Yu J, et al. Impact of composting strategies on the degradation of nonylphenol in sewage sludge [J]. Ecotoxicology, 2015, 24(10):2081-2087.

[25] GB/7959-2012 .糞便無(wú)害化衛(wèi)生要求 [S]. GB/7959-2012 Hygienic requirements for harmless disposal of nightsoil [S].

[26] Du J, Zhang Y, Qu M, et al. Effects of biochar on the microbial activity and community structure during sewage sludge composting [J]. Bioresource Technology, 2019,272:171-179.

[27] Bernal M, Alburquerque J, Moral R. Composting of animal manures and chemical criteria for compost maturity assessment. A review [J]. Bioresource Technology, 2009,100(22):5444-5453.

[28] 李 赟,袁 京,李國(guó)學(xué),等.輔料添加對(duì)廚余垃圾快速堆肥腐熟度和臭氣排放的影響 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2017,37(3):1031-1039. Li Y, Yuan J, Li G X, et al. Use of additive to control odors and promote maturity of municipal kitchen waste during aerobic composting [J]. China EnvironmentalScience, 2017,37(3):1031-1039.

[29] García C, Hernández T, Costa F. Study on water extract of sewage sludge composts [J]. Soil Science and Plant Nutrition, 1991,37(3): 399-408.

[30] NY/525-2012 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[S]. NY/525-2012 Agricultural industry standard of the People's Republic of China [S].

[31] 霍培書,陳雅娟,程旭艷,等.添加VT菌劑和有機(jī)物料腐熟劑對(duì)堆肥的影響 [J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2013,7(6):2340-2343. Huo P S, Chen Y J, Cheng X Y, et al. Effect of inoculating VT microbes and organic matter-decomposing inoculant on high- temperature aerobic composting [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2013,7(6):2340-2343.

[32] Ekinci K, Keener H, Elwell D. Composting short paper fiber with broiler litter and additives [J]. Compost Science & Utilization, 2000,8(2):160-172.

[33] 楊 玖,谷 潔,張友旺,等.磺胺甲噁唑?qū)ωi糞堆肥過(guò)程中堆料性質(zhì)與酶活性的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2013,33(12):3267-3274.Yang J, Gu J, Zhang Y W, et al. Effect of sulfamethoxazole on properties and enzymes activities during composting [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2013,33(12):3267-3274.

[34] Paredes C, Cegarra J, Bernal M P, et al. Influence of olive mill wastewater in composting and impact of the compost on a Swiss chard crop and soil properties [J]. Environment International, 2005,31(2): 305-312.

[35] Riffaldi R, Levi-Minzi R, Pera&dagger A, et al. Evaluation of compost maturity by means of chemical and microbial analyses [J]. Waste Management &Research, 1986,4(1):387-396.

[36] 任省濤,郭夏麗,蘆阿虔,等.林可霉素菌渣堆肥微生物群落多樣性分析[J]. 環(huán)境科學(xué), 2018,39(10):427-434.Ren S T, Guo X L, Lu A Q, et al. Microbial community diversity analysis during composting of lincomycin mycelia dreg with manure [J]. Environmental Science, 2018,39(10):427-434.

[37] 鄧雯文,陳姝娟,何雪萍,等.雞糞-堆肥中重金屬殘留?抗生素耐藥基因及細(xì)菌群落變化研究 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2019,38(2):439- 450.Deng W W, Chen S J, He X P, et al. Dynamics of heavy metal residues, antibiotic resistance genes, and bacterial communities during chicken manure composting [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2019, 38(2):439-450.

[38] Sabine P, Stefanie K, Frank S, et al. Succession of microbial communities during hot composting as detected by PCR–single- strand-conformation polymorphism-based genetic profiles of small- subunit rRNA genes [J]. Applied Microbiology, 2000,66(3):930-936.

[39] Huang K, Li F, Wei Y, et al. Changes of bacterial and fungal community compositions during vermicomposting of vegetable wastes by Eisenia foetida [J]. Bioresource Technology, 2013,150:235-241.

[40] Neher D A, Weicht T R, Bates S T, et al. Changes in bacterial and fungal communities across compost recipes, preparation methods, and composting times [J]. Plos One, 2013,8(11):e79512.

[41] Gu W, Lu Y, Tan Z, et al. Fungi diversity from different depths and times in chicken manure waste static aerobic composting [J]. Bioresource Technology, 2017,239:447-453.

[42] Tian X, Yang T, He J, et al. Fungal community and cellulose- degrading genes in the composting process of Chinese medicinal herbal residues [J]. Bioresource Technology, 2017,241:374-383.

[43] Zhang L, Zhang H, Wang Z, et al. Dynamic changes of the dominant functioning microbial community in the compost of a 90-m3aerobic solid state fermentor revealed by integrated meta-omics [J]. Bioresource Technology, 2016,203:1-10.

[44] Basotra N, Kaur B, Di Falco M, et al.(Syn.): Repertoire of a diverse array of efficient cellulases and hemicellulases in the secretome revealed [J]. Bioresource Technology, 2016,222:413-421.

[45] Zhang W, Huang M-h, Qi F-f, et al. Effect of trace tetracycline concentrations on the structure of a microbial community and the development of tetracycline resistance genes in sequencing batch reactors [J]. Bioresource Technology, 2013,150:9-14.

[46] 時(shí)紅蕾,王曉昌,李 倩,等.四環(huán)素對(duì)人糞便好氧堆肥過(guò)程及微生物群落演替的影響 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2018,39(6):308-316.Shi H L, Wang X C, Li Q, et al. Effects of elevated tetracyclineconcentrations onaerobic composting ofhuman feces: composting behavior and microbialcommunity succession [J]. Environmental Science, 2018,39(6):308-316.

[47] Aquino A, Jorge J A, Terenzi H F, et al. Studies on a thermostable α-amylase from the thermophilic fungus[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003,61(4):323-328.

[48] Zeng Q Y, Westermark S O, Rasmuson-Lestander A, et al. Detection and quantification ofin aerosols by real-time PCR, conventional PCR, and cultivation [J]. Applied Environmental Microbiology, 2004,70(12):7295-7302.

[49] Tortosa G, Castellano-Hinojosa A, Correa-Galeote D, et al. Evolution of bacterial diversity during two-phase olive mill waste ("alperujo") composting by 16S rRNA gene pyrosequencing [J]. Bioresource Technology, 2017,224:101-111.

[50] 張文浩,門夢(mèng)琪,許本姝,等.牛糞稻秸新型靜態(tài)堆肥中真菌群落組成的動(dòng)態(tài)特征[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2018,37(9):2029-2036.Zhang W H, Men M Q, Xu B S, et al. Dynamic characteristics of the composition of the fungal community in a novel static composting system of dairy manure and rice straw [J]. Journal of Agro- Environment Science, 2018,37(9):2029-2036.

Effect of additives on the succession of fungal community in different phases of cattle manure composting.

GE Mian-shen1,2, ZHOU Hai-bin2, SHEN Yu-jun2, MENG Hai-bo2, ZHOU Jun1*, DONG Shan-shan2, LI Ran2, ZHANG Xi2, CHENG Hong-sheng2, WANG Jian2

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China；2.Institute of Energy and Environmental Protection, Chinese Academy of Agricultural Engineering Planning & Design, Key Laboratory of Technologies and Models for Cyclic Utilization from Agricultural Resource of Ministry of Agriculture, Beijing 100125, China)., 2019,39(12)：5173~5181

In order to investigate the effect of physical additives on the fungal community structure during the composting of cattle manure, a 30-day composting experiment was carried out with cattle manure and wheat straw as raw materials, and biochar and volcanic rocks as additives. The requirements of harmless and stablilization of cattle manure composting were achieved in experiments. High-throughput sequencing results showed thatwas dominant in composting raw materials, with a relative abundance of 86.85%. In the thermophilic phase,andwere the dominant genus in the control treatment and volcanic rocks treatment, while the relative abundance ofandwas higher in the biochar treatment.andwere dominant in the cooling phase, and the relative abundance ofin the biochar treatment was higher than that in the other two treatments. In the maturity phase, the relative abundance ofwas the highest among all the treatments. The addition of volcanic rocks increased the abundance ofand. Spearman correlation analysis showed thatwas significantly correlated with GI, TN, TP, NH4+-N, moisture content, pH, VS and urease (<0.05). This study provides references for the research on mechanism and process modification of cattle manure composting.

cattle manure composting；biochar；volcanic rocks；fungi；community structure

X705

A

1000-6923(2019)12-5173-09

葛勉慎(1994-),男,江蘇泰州人,南京工業(yè)大學(xué)碩士研究生,主要從事固體廢棄物資源化利用研究.

2019-06-13

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2017YFD0800202);寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃對(duì)外科技合作專項(xiàng)(2019BFH02008)

* 責(zé)任作者, 副教授, zhoujun@ njtech.edu.cn