薛浩 后軍

骨結(jié)合是種植體穩(wěn)定和長久的基礎(chǔ)。對種植體表面進(jìn)行處理是增加骨結(jié)合的有效手段。隨著3D打印技術(shù)的迅速發(fā)展，可以個性化設(shè)計出具有特殊表面結(jié)構(gòu)的植體，并個性化打印。3D打印多孔鈦種植體表面具有均勻可控的多孔結(jié)構(gòu)，同時，成型精度高、重復(fù)性好和具有良好的機(jī)械性能。海藻酸鈉（SA）是從天然褐藻里提取的一種多糖，具有良好的生物相容性和可降解性，SA溶液遇到二價的金屬離子會生成凝膠，經(jīng)過凍干技術(shù)可形成具有三維結(jié)構(gòu)的支架[1]。通過將無機(jī)生物材料摻入到SA支架中可有效克服其機(jī)械性能差的缺陷，羥基磷灰石（HA/HAP，以下均簡寫為HA）是人體硬組織（骨和牙齒）的無機(jī)相成分，HA材料能夠模仿骨的天然胞外基質(zhì)并促進(jìn)骨和軟骨細(xì)胞的粘附，具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性[2]。

本研究中，在3D打印多孔鈦表面均勻孔隙中加載SA/HA復(fù)合微支架結(jié)構(gòu)，然后經(jīng)體內(nèi)動物實驗和CBCT掃描，通過對這種復(fù)合支架結(jié)構(gòu)周圍骨密度值的測量分析，研究這種特殊支架結(jié)構(gòu)對成骨的影響。

資料與方法

1多孔鈦制備和分組

使用SolidWorks2016軟件設(shè)計有孔試件的三維模型（參數(shù)：直徑D=10mm，高度H=2mm，內(nèi)孔直徑d=500μm，高度h=1mm）。選擇性激光燒結(jié)制備出試件60枚，其中無孔鈦片20枚（對照組，記作NPO組），有孔鈦片40枚，有孔鈦片中隨機(jī)選取20枚作為多孔組（陰性對照組，記作PO組），剩下20枚作為加載組（實驗組，記作LPO組）。三組分別在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲震蕩各15分鐘，干燥備用。

2加載SA/HA微支架

首先，取3.0gSA粉末在70℃去離子水中溶解成溶液，稱取1.0g緩釋劑一（乙二胺四乙酸二鈉鈣）溶解在SA溶液中，置于攪拌機(jī)中均勻攪拌1小時。加入1.0gHA粉末（SA：HA=3:1），均勻混合攪拌1小時。最后，加入緩釋劑二（葡萄糖酸內(nèi)酯）1.0g，攪拌均勻后，將所得混合物均勻覆蓋在載有LPO組鈦試件的孔板中，然后，將孔板迅速置于真空壓力泵中，真空狀態(tài)下持續(xù)24小時，利用持續(xù)的負(fù)壓作用，使加載組鈦試件孔隙中充滿SA/HA混合懸濁液。去除試件表面多余凝膠，小心將試件置于-20℃冰箱中過夜，然后再置于-80℃冷凍干燥機(jī)中凍干24小時，最后形成孔隙中均勻充滿SA/HA微支架的復(fù)合支架結(jié)構(gòu)。

3表面分析采用

SEM對三組支架表面形貌進(jìn)行觀察，同時，通過XPS檢測三組試件表面的元素組成。

4手術(shù)

6只比格犬術(shù)前12小時禁食，手術(shù)前2小時肌肉注射青霉素（40萬u/d），術(shù)中行速眠新（0.08ml/kg）和戊巴比妥鈉（0.8ml/kg）復(fù)合麻醉。分別對四肢股骨區(qū)域進(jìn)行備皮，消毒，鋪巾，切開表皮并分離筋膜和肌肉，暴露出支架植入?yún)^(qū)域股骨，支架植入?yún)^(qū)域位于后肢股骨髁部近心端，生理鹽水冷卻，使用直徑為10mm的空心環(huán)柱形骨鋸和慢速直機(jī)配球鉆進(jìn)行種植窩預(yù)備，預(yù)備完成后，分別植入三組鈦試件（分別在各組中隨機(jī)抽取5枚），分層嚴(yán)密縫合。術(shù)后，抗生素(頭孢唑啉，20毫克/公斤)在術(shù)后3天內(nèi)進(jìn)行了注射，傷口每天消毒。在整個術(shù)后的康復(fù)期里，嚴(yán)密觀察比格犬的恢復(fù)狀況和術(shù)區(qū)感染情況。股骨種植區(qū)暴露如圖1所示。

圖1 植入復(fù)合支架

5骨密度測量術(shù)后1、3、6月，在麻醉狀態(tài)下，對每支實驗犬進(jìn)行CBCT掃描，應(yīng)用自帶的Simplant軟件對三組支架與犬股骨接觸區(qū)域進(jìn)行骨密度值的測量。每個標(biāo)本選擇3個矢狀截面，層厚0.5mm，每個截面測量單位面積（1.00mm2）支架兩端和中間3個位點的骨密度值，取平均值進(jìn)行比較。如圖2所示。

圖2 骨密度測量示意圖

6統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。對同一時間點數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較采用SNK檢驗，檢驗水準(zhǔn)雙側(cè)ɑ=0.05。

結(jié)果

1 表面形貌

采用SEM檢查，可以觀察到：NPO組（圖3A，3D）表面呈現(xiàn)出無設(shè)計的3D打印的表面鈦合金表面形貌，不規(guī)則粗糙，可見未熔融金屬顆粒；PO（圖3B，3E）組可見均勻規(guī)則的孔隙，孔隙內(nèi)無加載；LPO（圖3C，3F）組試件表面同樣可見均勻規(guī)則孔隙，孔隙中均勻分布著不規(guī)則互相連通的多孔支架結(jié)構(gòu)，支架周圍與多孔鈦內(nèi)壁相連，支架孔隙的孔徑范圍從20到200μm不等，支架表面可見白色HA顆粒，均勻分布。

圖3 三組試件在SEM下表面形貌圖

2 表面元素分析

圖4 X射線光電子能譜

XPS檢測分析元素組成如圖所示：三組均含有C，N，O元素，NPO和PO組表面元素和曲線一致；LPO組較其他兩組，N，O元素峰值顯著增高。說明實驗組加載了含N，O元素的HA/SA微支架結(jié)構(gòu)。

3 骨密度測量

術(shù)后3月，三組支架材料CBCT測量值在某個矢狀截面的數(shù)值如圖5所示，各時間點三組鈦支架表面骨密度測量均值如表1所示，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LPO組骨密度均值明顯大于NPO和PO組，三組兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 骨密度測量

表 1 三組植入支架表面骨密度值（HU，±s）

表 1 三組植入支架表面骨密度值（HU，±s）

與NPO組比較：*P＜0.01；與PO組比較#P＜0.05。

組別 例數(shù)HU 1 3 6 NPO 5 730.25±211.45 975.67±168.59 1014.75±138.37 PO 5 980.75±251.85* 1193.89±251.93* 1251.67±231.47*LPO 5 1146.12±209.33*# 1493.78±165.17*# 1620.33±171.82*#

討論

理想的種植體在與周圍組織發(fā)生反應(yīng)后不能導(dǎo)致機(jī)體組織的繼發(fā)性改變，其表面微觀形貌應(yīng)有利于毛細(xì)血管的新生和與骨組織形成良好的機(jī)械鎖結(jié)作；同時，必須具有一定機(jī)械強(qiáng)度及與界面骨組織相近的彈性模量，以便承受咬合力和將力均勻分散。理想的種植體必須具有理想的生物相容性，表面形貌還應(yīng)具備在植入體內(nèi)后有利于蛋白的快速吸附，細(xì)胞的粘附、增殖、分化，以及具有骨誘導(dǎo)作用以縮短界面骨結(jié)合時間，同時應(yīng)具有良好的抗腐蝕性能[3，4]，可以阻止細(xì)菌在表面附著，同時提供生物活性因子。通過對種植體表面的處理改性，在表面形成具有誘導(dǎo)骨組織的形成和達(dá)到生物化學(xué)結(jié)合的生物活性膜或涂層。關(guān)于種植體的表面處理，前人嘗試過各種方法，如傳統(tǒng)機(jī)械加工的光滑表面，HA和殼聚糖表面涂層，鈦離子噴涂處理，噴砂、酸蝕處理，微弧氧化和激光表面處理等[5-7]。

選擇性激光燒結(jié)是3D打印技術(shù)中的一種，它通過纖維激光逐層熔化燒結(jié)金屬粉末從而得到所想要的物體結(jié)構(gòu)。這種新興技術(shù)能夠設(shè)計出任意尺寸和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，同時避免了化學(xué)污染，實現(xiàn)了個性化定制[8-10]。

HA材料能夠模仿骨的天然胞外基質(zhì)并促進(jìn)骨和軟骨細(xì)胞的粘附，具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性。藻酸鹽及其與HA的復(fù)合支架在生物醫(yī)學(xué)中表現(xiàn)出極好的應(yīng)用，由于藻酸鹽支架缺乏足夠機(jī)械強(qiáng)度來模擬骨的天然功能，它與無機(jī)材料如HA結(jié)合以增強(qiáng)強(qiáng)度以及骨組織形成。支架在骨組織工程中的理想作用是通過機(jī)械強(qiáng)度，細(xì)胞增殖和內(nèi)壁表面形態(tài)為新的骨組織生長提供最佳條件。Luo Yet等[11]通過3D繪圖技術(shù)和原位礦化制造的具有HA層的藻酸鹽/納米HA復(fù)合支架，有助于細(xì)胞附著和鋪展，支持蛋白質(zhì)釋放。Yan Jet等[12]設(shè)計研究出可注射SA/HA凝膠支架結(jié)合明膠微球用于藥物遞送和釋放及成骨實驗研究。Wang Qet等[13]通過3D打印出Atsttrin/nHA支架，通過干預(yù)TNF/TNFR促進(jìn)骨缺損再生，研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)精確，抗炎，促進(jìn)成骨。

真空冷凍干燥技術(shù)的原理是先將原始物料冷凍起來，使富含水分的部分凝結(jié)形成冰塊，接著在真空條件下，通過升華作用使物料達(dá)到干燥目的。該技術(shù)降低了物料的氧化變質(zhì)，滅除物料中的細(xì)菌，物料原本的外形能得到很好的保留，并保證了品質(zhì)[14，15]。本實驗采用選擇性激光燒結(jié)技術(shù)，通過軟件設(shè)計并打印出具有均勻孔隙的多孔鈦支架結(jié)構(gòu)，鈦合金試件表面及孔隙表面具有微粗糙度，對成骨細(xì)胞粘附起促進(jìn)作用。通過冷凍干燥技術(shù)，在孔隙中加載SA/HA微支架，獲得更適合成骨細(xì)胞長入的微孔隙結(jié)構(gòu)，利用微支架良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，促進(jìn)新骨的形成和長入。通過CBCT對支架與骨結(jié)合處骨密度值的掃描測量，發(fā)現(xiàn)加載SA/HA微支架的實驗組獲得了更高的骨密度均值，在支架周圍形成更多的新骨。

綜上所述，3D打印多孔鈦表面孔隙中加載SA/HA微支架結(jié)構(gòu)具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性，可以促進(jìn)新骨的形成和長入。為后期3D打印種植體的研究具有促進(jìn)作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。