糞菌低溫保存的研究進(jìn)展

(1 上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093) 2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院環(huán)境與兒童健康教育部和上海市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200092)

近年來，宏基因組測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展使人類進(jìn)一步認(rèn)識(shí)了腸道菌群。腸道菌群對(duì)炎癥[1]、代謝性疾病[2]、肥胖[3]、精神障礙[4]等疾病有重要影響，研究相關(guān)微生物組成和變化有助于預(yù)防、診斷并最終治愈多種疾病。糞便采集為腸道菌群的研究提供了一種非侵入性采樣方法，廣泛的用于宏基因組研究。過去10年，關(guān)于糞便微生物與人類健康的雙向關(guān)系取得了很多研究成果[5]。

糞菌移植和疾病科學(xué)研究的需求推動(dòng)了糞菌庫的建設(shè)。然而，糞便樣本采集后，儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)淖罴褩l件仍然不明確。通常，糞便樣本需要在-20 ℃或更低溫度下冷凍儲(chǔ)存，然后通過冷鏈轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。但是這種操作在偏遠(yuǎn)的野外地區(qū)或一些欠發(fā)達(dá)地區(qū)不易實(shí)現(xiàn)，還可能大幅增加成本，于是人們開始研究干燥保存等其他方式，保存效果因物種、樣本暴露的溫度和時(shí)間等不同而變化[6]。

本文闡述了低溫保存微生物及細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制，總結(jié)了糞菌保存的主要作用，回顧了關(guān)于糞菌采集和保存方法的研究成果，研究影響其保存效果的主要因素，并對(duì)未來糞菌保存的可行方法和研究方向進(jìn)行展望，希望能有助于研究人員建立更合理的保存方案。

1 低溫保存的機(jī)制

1.1 低溫?fù)p傷

低溫保存在活細(xì)胞和組織中的應(yīng)用徹底改變了生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在生物和醫(yī)學(xué)中，低溫范圍比較廣，可以從稍低于正常體溫(37 ℃)直到-196 ℃。成功的低溫保存需要在超低溫下冷凍細(xì)胞，在冷凍過程中水轉(zhuǎn)變?yōu)楸鶐淼纳锖臀锢碜兓窃斐蓳p害的主要原因，而并非低溫本身。P. Mazur等[7]提出了冷凍損傷的“兩因素假說”，即“溶液損傷”和“胞內(nèi)冰損傷”。劉威等[8]詳細(xì)討論了關(guān)于胞內(nèi)冰形成的主要機(jī)制。這兩類損傷不僅會(huì)造成細(xì)胞形態(tài)和功能的改變，還會(huì)使胞內(nèi)生物大分子(如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂類等)降解或突變，造成細(xì)胞的無效保存[9]。

綜合兩方面的因素，必然存在最佳冷卻速率，表征細(xì)胞的最佳存活率。冷凍保存技術(shù)可分為兩類：程序法慢速冷凍和玻璃化保存，如圖1所示。

圖1 細(xì)胞存活率與冷卻速率的關(guān)系

1.2 低溫保護(hù)劑的作用機(jī)理

低溫保存是生物樣本長期保存的重要方法，而低溫保護(hù)劑(cryoprotectant，CPA)可以保護(hù)細(xì)胞免受滲透損傷，維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，并對(duì)生物大分子產(chǎn)生一定保護(hù)作用[9]。S. Sari?zkan等[10]將大鼠的精子冷藏保存在4 ℃，發(fā)現(xiàn)棉子糖、海藻糖和果糖有助于保護(hù)精子的運(yùn)動(dòng)性、形態(tài)和DNA完整性。J. Botling等[11]認(rèn)為RNAlater試劑能更有效地阻止凍存樣本的RNA降解，保持生物大分子的完整性。

按保護(hù)劑是否能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可將其分為滲透型和非滲透型兩種。常用的滲透型保護(hù)劑有甘油、乙二醇、二甲基亞砜、乙酰胺等。這類保護(hù)劑多屬低分子物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，增加溶液黏性，弱化水的結(jié)晶過程[12]。保護(hù)劑可以替代胞外電解質(zhì)滲透入細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞外凍結(jié)時(shí)，能夠減輕細(xì)胞皺縮程度，減小滲透腫脹，從而降低凍融對(duì)細(xì)胞的傷害[13]。非滲透型保護(hù)劑包括糖類和一些大分子物質(zhì)(葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇等)。這類物質(zhì)能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞。其加入到溶液后可使溶液呈過冷狀態(tài)，抑制冰晶形成，降低特定溫度下的電解質(zhì)濃度，從而起到保護(hù)作用。

還有一些天然的保護(hù)劑，如冰成核劑(ice-nucleating agents，INA)和抗凍蛋白(anti-freeze proteins，AFP)[14]。冰成核劑可以控制冰的形成位置，在合適的位置適度促進(jìn)冰的形成，耐冷性林蛙(rana sylvatica)血漿中的蛋白質(zhì)已被證明具有INA特性[15]。AFP能保證某些物種在零下溫度的環(huán)境中生存。不像其他的保護(hù)劑，AFP以非依數(shù)性的方式遲滯水溶液的冰點(diǎn)，而不影響其熔點(diǎn)，其活性取決于冰點(diǎn)和熔點(diǎn)的差值大小。AFP能夠抑制冰晶的生長是依靠一種吸附-抑制機(jī)制，可與特定表面的冰晶結(jié)合，從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)角度而言，均不利于冰晶生長。AFP還能維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，有助于抑制復(fù)溫過程的重結(jié)晶。因此，在低溫保存中將AFP結(jié)合其他保護(hù)劑一起使用意義重大。“阻冰”的概念啟發(fā)人們尋找能夠發(fā)揮這種功能的合成化合物，如R. C. Deller等[16]發(fā)現(xiàn)聚乙烯醇有類似的作用，這類保護(hù)劑可能在未來具有更廣泛的研究和應(yīng)用價(jià)值。

2 糞菌的低溫保存

2.1 糞菌低溫保存的應(yīng)用

2.1.1 臨床應(yīng)用——糞菌移植

糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是將健康人的糞便處理為混懸液狀態(tài)，以某種途徑移植到患者胃腸道內(nèi)，利用正常糞便中的功能菌群，在患者體內(nèi)重建具有多樣性的腸道菌群，對(duì)腸道及腸道外的疾病實(shí)現(xiàn)有效診療[17]。近幾年FMT已成為生物醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。

腸道菌群異常是導(dǎo)致各種腸道疾病的重要原因。嚴(yán)重的腸道細(xì)菌感染一般均使用抗生素治療，但當(dāng)所有可用的抗生素都無濟(jì)于事時(shí)，糞菌移植可能是唯一的希望。FMT成為醫(yī)學(xué)突破，不是技術(shù)或理論的突破，而是認(rèn)識(shí)的突破[18]。FMT治療復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染(clostridium difficile infection，CDI)已被列入《臨床診療指南》[19]。最近一項(xiàng)研究顯示，F(xiàn)MT對(duì)于CDI的總體治愈率可達(dá)92%[20]，其有效性和安全性在進(jìn)一步研究中得到了證實(shí)[21-22]。

許多研究揭示了FMT在治療炎癥性腸病[23]、腸易激綜合征[24]、便秘[25]、代謝綜合征[26]等疾病中的潛在治療價(jià)值。

FMT推薦使用新鮮糞菌液，但在臨床應(yīng)用中通常無法隨時(shí)隨地獲得新鮮健康的樣本，為了進(jìn)行異地治療或延長糞菌的有效期，有必要提前對(duì)其進(jìn)行采集和保存。如何實(shí)現(xiàn)糞菌的有效儲(chǔ)存，如今還面臨較大的挑戰(zhàn)[27]。將糞菌冷凍于-80 ℃是常用的技術(shù)方法之一。Jiang Z. D. 等[28]對(duì)患者進(jìn)行相同供體的FMT時(shí)，發(fā)現(xiàn)新鮮菌液和冷凍菌液的有效性相似，而與新鮮樣本相比，凍干樣本的功效略低。因此，糞菌的保存方法是影響FMT臨床治療效果的重要因素之一。

2.1.2 科學(xué)研究

保存的糞菌除了可用作臨床治療外，在人類生命健康的研究中也有重要作用。糞便樣本廣泛用于宏基因組研究，旨在闡明人類健康與腸道微生物群之間的關(guān)系[29]；在大規(guī)模流行病學(xué)研究中，用有效的手段保存糞便樣本，進(jìn)行微生物群落分析，從而展開前瞻性研究[30]；在非靶向性代謝組學(xué)分析中，糞便樣本也有普遍的應(yīng)用價(jià)值[31]。

糞菌還可用于評(píng)估野生動(dòng)物的健康，研究宿主和環(huán)境之間的相互作用。包括糞便類固醇激素分析[32]、寄生蟲檢測[33]和種群的遺傳相關(guān)性[34]等。但常見的保存方法(如-80 ℃下冷凍)不適用于野外采集。因此許多研究都在優(yōu)化野生動(dòng)物的糞便保存方案，表明新型保存方法的探索是未來的研究方向之一。

2.2 糞菌的低溫保存方法

影響糞菌有效性的因素較多，如樣本的收集、運(yùn)輸、均質(zhì)化[35]、保存和二次取樣等。為了滿足臨床應(yīng)用及科研需求，保持菌種的優(yōu)良特性非常重要，這就需要長期保持菌種不發(fā)生變異，即菌種的形態(tài)、遺傳特性、功能等不發(fā)生改變。在微生物的眾多保存方法中，冷凍保存法和冷凍干燥保存法是公認(rèn)的長期保存微生物菌種最安全、可靠的方法[36]。糞菌的低溫保存方法可分為4類：冷凍保存、冷凍干燥保存、冷藏保存、其他非低溫保存。

2.2.1 冷凍保存

冷凍保存一般是將均質(zhì)化后的等分糞便試樣置于-196 ℃(液氮)、-80 ℃或-20 ℃的環(huán)境中進(jìn)行保存。這種方法通常被視為微生物的“黃金保存法”[37]，因?yàn)榈蜏乜捎行б种莆⑸锷L，并保持較高的DNA濃度。

液氮超低溫保存法已成功應(yīng)用于乳酸菌、酵母菌、微型藻類和原生動(dòng)物等生物體的保存[36]。乳酸菌是糞便樣本中的主要菌群之一，其保存效果對(duì)樣品的保存有直接影響。F. Fonseca等[38]首次研究了冷卻速度和保存溫度對(duì)乳酸菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)以甘油作為保護(hù)劑，乳酸菌以任何冷卻速率保存時(shí)，胞內(nèi)均無冰晶形成，將其直接浸入液氮中獲得的高冷卻速率會(huì)使細(xì)胞活力的損失降到最低。因此液氮保存是一種有效的方法，但目前關(guān)于糞菌液氮保存的具體研究還較少。

冷凍保存糞菌樣本的目的有兩個(gè)：1)為了保存菌種的活性；2)保存樣本中穩(wěn)定的DNA或其他生物標(biāo)志物。第一個(gè)目的可用于FMT以替代新鮮糞菌，解決異地治療的問題。Tang Guihua等[39]證明了在復(fù)發(fā)性或難治性CDI患者中，冷凍FMT與新鮮FMT一樣有效。S. P. Costello等[40]研究發(fā)現(xiàn)，用于治療復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染的糞菌微生物可以安全地在10%甘油中冷凍儲(chǔ)存至少6個(gè)月，而不會(huì)失去臨床功效或活力，第一次FMT對(duì)于復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染的治愈率為88%，病癥復(fù)發(fā)后的再次FMT治愈率為100%。第二個(gè)目的用于各種科學(xué)研究。F. Fouhy等[41]將新鮮分離的糞菌在干冰上快速冷凍或在-80 ℃下冷凍7 d，然后提取DNA并與新鮮樣本對(duì)照，發(fā)現(xiàn)種群分布沒有顯著差異，快速冷凍的樣本保持了微生物群落的完整性。

一些研究也將用于細(xì)胞的傳統(tǒng)低溫保護(hù)劑應(yīng)用于糞菌的低溫保存中，比較常用的是甘油。M. Aguirre等[42]將制備的人糞便樣本重懸在含有甘油的保護(hù)劑中，然后在-80 ℃下儲(chǔ)存，結(jié)果與新鮮糞便樣本的細(xì)菌代謝活性和微生物群落分布高度一致，并建議將冷凍后的糞便物質(zhì)作為新鮮糞便替代物用于體外發(fā)酵研究。K. R. Horng等[43]使用甘油與磷酸緩沖鹽溶液保存樣本，發(fā)現(xiàn)在-80 ℃保存時(shí)能夠明顯提高樣本DNA濃度和香農(nóng)多樣性指數(shù)。F. M. Kerckhof等[44]使用3種低溫保護(hù)劑(二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、DMSO+海藻糖和DMSO+胰蛋白酶大豆肉湯)對(duì)樣本進(jìn)行的-80 ℃超低溫保存，發(fā)現(xiàn)糞便中微生物的活性沒有因?yàn)镃PA的添加而增大，但是這種方法能夠保持較好的群落結(jié)構(gòu)(通過基因測序確定)。

除了傳統(tǒng)保護(hù)劑外，還有很多特殊保護(hù)劑的組合能夠?qū)崿F(xiàn)樣本在略高溫度(-20 ℃)下穩(wěn)定保存。Qiao Ying等[45]開發(fā)了一種使用天然深共晶溶劑(natural deep eutectic solvents，NADES)冷凍保存乳酸菌的新方法，研究了在-20 ℃下，24 h短期和180 d長期低溫保存期間乳酸菌的存活率，證明了由甘油和L-脯氨酸制備的NADES 能提高細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性并有效(P<0.05)維持嗜熱鏈球菌內(nèi)兩種酶的活性?？梢妼?duì)于微生物的保存還有很多保護(hù)劑待開發(fā)，將一些新型高效的保護(hù)劑用于糞菌保存可能會(huì)有更好的效果。

2.2.2 冷凍干燥保存

冷凍干燥保存法利用了干燥、低溫和隔絕空氣的條件，降低微生物新陳代謝的速度，使細(xì)胞的生命活動(dòng)處于半永久性休眠狀態(tài)，可以長時(shí)間保存且避免細(xì)菌的污染和變異。L. Bircher等[46]定量對(duì)比了冷凍和凍干保存的效果以及保護(hù)劑對(duì)6種厭氧腸道微生物活力和適應(yīng)性的影響，發(fā)現(xiàn)添加蔗糖和菊粉能提高菌種凍干后的細(xì)胞活力和完整細(xì)胞的比例。K. Elahe等[47]在膳食礦物質(zhì)平衡的研究中將糞菌冷凍干燥，并在-20 ℃下保存10年，發(fā)現(xiàn)其微生物特征依然能保持穩(wěn)定。

供體糞菌的冷凍已簡化FMT治療復(fù)發(fā)性CDI的過程，凍干的糞菌也可能達(dá)到類似的效果。Jiang Z. D. 等[48]將冷凍和凍干的FMT樣本儲(chǔ)存長達(dá)7個(gè)月，其微生物群的組成和治療功效沒有發(fā)生顯著改變。將糞菌凍干保存后，還可制作成包封的膠囊以治療疾病。C. Staley等[49]將糞菌進(jìn)行凍干并包封，使用蔗糖、海藻糖和甘露醇作為低溫保護(hù)劑，在凍干機(jī)(-20 ℃的擱板溫度冷凍36 h，在30 ℃下干燥6 h)中處理后保存于20 ℃直至使用，發(fā)現(xiàn)凍干制劑滿足所有預(yù)設(shè)目標(biāo)，包括物理化學(xué)性質(zhì)、包封容易性、不同溫度下的穩(wěn)定性以及體內(nèi)外微生物群的活力。但也有研究者認(rèn)為凍干糞菌效果沒有冷凍的效果好[28]。

2.2.3 冷藏保存

冷藏保存法是在4 ℃的冷藏箱內(nèi)保存樣本，同時(shí)將有機(jī)化學(xué)溶劑作為保護(hù)劑以限制其他細(xì)菌的生成，在一定程度上殺死細(xì)菌，抑制酶的活性[33]。最常見的用于糞菌保存的保護(hù)介質(zhì)有乙醇、甲醇、RNAlater、FTA(flinders technology associates)卡、糞便隱血試驗(yàn)(fecal occult-blood test，F(xiàn)OBT)卡和OMNIgene Gut試劑盒等，這些是更加適合現(xiàn)場的保存方法，但保存有效期較短。與冷凍相同，用乙醇或甲醇進(jìn)行冷藏保存是另一類有效的糞菌DNA保存方法，但由于這些試劑是“危險(xiǎn)化學(xué)品”，在偏遠(yuǎn)地區(qū)不容易訂購或運(yùn)輸。RNAlater是一種保存RNA和DNA的無害液體。與乙醇相比，RNAlater的運(yùn)輸限制雖然較少，但其可能會(huì)隨時(shí)間降解，從而降低DNA的濃度[43]。推測糞便樣本中殘留的RNAlater可能干擾DNA提取過程中的細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)消化，從而抑制DNA分離[43]。FTA卡易攜帶，在現(xiàn)場樣品收集時(shí)最方便。FOBT卡是臨床經(jīng)常用的保存方法，容易買到，價(jià)格便宜、體積小，且易于使患者接受。

S. J. Song等[50]用5種方法(70%乙醇、95%乙醇、RNA later、FTA卡和OMNIgene Gut試劑盒)保存人類和狗的糞便標(biāo)本，時(shí)間長達(dá)8周，他們發(fā)現(xiàn)3種方法(95%乙醇、FTA卡和OMNIgene Gut試劑盒)可以在4 ℃下乃至室溫穩(wěn)定保存樣本，且不建議使用70%乙醇。DNA在95%～100%的乙醇中保存效果最好，因?yàn)楦邼舛纫掖寄芨焖俚臐B透細(xì)胞膜并使DNA酶失活。他們的實(shí)驗(yàn)包含了1 200多個(gè)樣本，為研究者提供了較為全面的參考。M. Papaiakovou等[51]使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)評(píng)價(jià)7種市售產(chǎn)品在不同溫度下保存鉤蟲DNA的有效性，發(fā)現(xiàn)在4 ℃時(shí)，60 d的保存周期內(nèi)，保存試劑對(duì)DNA擴(kuò)增效率沒有顯著影響，即使不添加保護(hù)劑，也可以使樣本穩(wěn)定7周以上。

很多研究者自主研發(fā)了糞菌保存液。Hao Lilan 等[52]研發(fā)了一種基于離子液體的試劑，該試劑可以在4 ℃下7 d的儲(chǔ)存期內(nèi)穩(wěn)定保存糞便樣本中微生物群的組成。這說明傳統(tǒng)商業(yè)試劑的保存效果還有提升改進(jìn)的空間。

以上的保護(hù)劑同樣適用于更高的保存溫度，如室溫。但保存溫度越高，可保存的時(shí)間就越短，建議在有條件的情況下，使用零下或4 ℃的低溫保存。在很多4 ℃保存糞菌的研究中，都只將DNA濃度或群落結(jié)構(gòu)作為測量指標(biāo)，而沒有考慮微生物的活性，說明這些方法可能僅僅為了保證樣本的遺傳物質(zhì)不發(fā)生改變以進(jìn)行科學(xué)研究，但想要長時(shí)間維持較高的菌群活性，還需要在冷凍方案的優(yōu)化上繼續(xù)探索。

2.2.4 其他非低溫保存

樣本的快速干燥能抑制微生物的DNA降解。最簡單的干燥保存法是將樣本去除雜質(zhì)后直接在溫度較高的烘箱中烘干，該方法簡單易行，烘干后的樣本易于攜帶和運(yùn)輸。但干燥保存法也有一定的缺陷，比如烘干的最佳溫度和時(shí)間難以掌握，會(huì)影響樣本中菌群的穩(wěn)定性，且烘箱不便于攜帶。P. J. Johnson等[53]評(píng)估了有可充電盒的便攜式干燥劑室的實(shí)用性，旨在研究快速干燥的樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，他們在室溫下將樣本置于該干燥劑系統(tǒng)中24 h或72 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱，發(fā)現(xiàn)與快速冷凍樣本相比，此裝置中保存的樣本僅顯示出微小群落變化，而在室溫下放置相同時(shí)間的樣本經(jīng)歷了幾次有氧菌或兼性厭氧菌的過度生長。

對(duì)常見的保存方法進(jìn)行總結(jié)，如表1所示?？梢园l(fā)現(xiàn)每種方法都各有利弊，在實(shí)際運(yùn)用過程中，要結(jié)合實(shí)驗(yàn)條件及研究目的進(jìn)行合理選擇，將某幾種方法結(jié)合使用也是可行的。

3 影響保存效果的主要因素

3.1 保存溫度

糞菌采集和保存的一般原則[59]為：1)避免冷凍-解凍循環(huán)：冷凍-解凍循環(huán)是導(dǎo)致糞便樣本DNA降解的關(guān)鍵因素，可能導(dǎo)致宏基因組DNA質(zhì)量差。2)避免反復(fù)溫度波動(dòng)：劇烈的溫度波動(dòng)是糞便樣本中很多細(xì)菌致死的主要原因，它可以殺死微生物并加劇DNA的降解。3)縮短運(yùn)輸時(shí)間：防止微生物不正常的增多或減少，而低溫保存可延長運(yùn)輸時(shí)間。

表1 糞便樣本常用保存方法的對(duì)比

因此，控制運(yùn)輸過程中的溫度十分重要。有研究表明，在4 ℃保存條件下，運(yùn)輸時(shí)間為24～48 h，微生物組成沒有顯著變化[60]，如果樣本可以在4 h內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室則無需保存[61]，一旦樣本到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)該在-80 ℃下長期冷凍保存。在-80 ℃冷凍后，糞便樣本可保持穩(wěn)定的微生物群落長達(dá)2年[62]，-20 ℃下的樣本貯存時(shí)間至少可以達(dá)到數(shù)月[63]。S. J. Song等[50]研究了6種溫度情況下糞便中微生物，包括-20 ℃、4 ℃、室溫、4 ℃轉(zhuǎn)移到室溫、凍融循環(huán)(-20 ℃～室溫)和野外條件下經(jīng)常遇到的高溫波動(dòng)(4～40 ℃)。這6種溫度，每種都對(duì)應(yīng)樣本保存時(shí)所面臨的實(shí)際溫度變化情況，具有研究價(jià)值。

在凍結(jié)樣本之前，建議將糞便分成若干等分，可以防止二次取樣時(shí)凍融循環(huán)對(duì)樣本的損害[64]。隨著樣本開始融化，DNA也隨之迅速降解，很難預(yù)測整個(gè)樣本的解凍時(shí)間。糞便等分吸管技術(shù)(fecal aliquot straw technique，F(xiàn)AST)[64]，允許簡單且可重復(fù)的二次取樣。

3.2 保存方法和保存時(shí)間

儲(chǔ)存方法和儲(chǔ)存時(shí)間會(huì)影響糞便樣本中的核酸質(zhì)量和菌群分布，從而影響微生物組相關(guān)數(shù)據(jù)。V. L. Hale等[56]研究表明保存方法和時(shí)間顯著改變DNA濃度和純度，香農(nóng)多樣性指數(shù)在保存方法和周數(shù)之間也存在顯著差異。J. S. Lim等[65]將豬糞儲(chǔ)存在-20、4、20、37 ℃的環(huán)境下，每隔7 d取樣測試，共保存28 d，結(jié)果表明，隨著溫度和儲(chǔ)存時(shí)間的增加，糞便中細(xì)菌群落的豐富度不斷降低。

3.3 其他

樣本在處理前是否經(jīng)過均質(zhì)化，也影響保存結(jié)果及后續(xù)檢測[35]，因?yàn)榧S便中不同采樣點(diǎn)的微生物群體不同。實(shí)驗(yàn)前可以通過渦旋增強(qiáng)保護(hù)劑對(duì)糞便的滲透[43]。保存一段時(shí)間后的樣本若需要進(jìn)一步應(yīng)用，可將樣本復(fù)溫，并通過離心的方法分離出緩沖液。

4 結(jié)論

本文對(duì)低溫保存這一過程進(jìn)行了綜述，解釋了低溫保存的機(jī)制，闡述了糞菌保存的意義，歸納了不同情況下樣本低溫保存方法的成果進(jìn)展，并提出影響其保存效果的重要因素，得出如下結(jié)論：

1)目前的保存方法還存在很多問題：運(yùn)輸溫度的允許波動(dòng)范圍和糞便樣本的允許轉(zhuǎn)運(yùn)持續(xù)時(shí)間仍然是不確定的，需要更多的數(shù)據(jù)來形成共識(shí)；一些保護(hù)劑的機(jī)理不明確，有待進(jìn)一步探索。

2)探索新型保護(hù)劑，降低保護(hù)劑毒性，提高保存效果。在細(xì)胞的低溫保存中探索出了很多新型高效的保護(hù)劑，比如海藻糖[67]和聚乙烯醇[17]等，它們能夠保護(hù)細(xì)胞免受低溫?fù)p傷。M. Hasan等[68]將抑制冰重結(jié)晶的聚合物(聚乙烯醇和聚乙二醇)作為CPA，與使用甘油的保存結(jié)果相比，解凍后大腸桿菌產(chǎn)量增加了4倍，且使用的CPA濃度更低。如果將此類保護(hù)劑用于糞菌的冷凍保存，可能會(huì)得到更好的保存效果，這可以成為未來的研究思路之一。

3)糞菌只有通過冷凍保存才具有較高活性，其他的方法只是保證其中的生物大分子(如DNA，RNA和蛋白質(zhì)等)不發(fā)生變異，或維持了微生物群落的穩(wěn)定性。而低溫保存領(lǐng)域的研究者尚未介入糞菌的活菌保存研究。除了優(yōu)化保護(hù)劑的種類以外，還可以深入研究不同的降溫程序?qū)S菌保存后的成活率、DNA濃度及種群分布等的影響。

4)隨著低溫生物學(xué)和腸道微生物學(xué)的發(fā)展，不斷改進(jìn)和開發(fā)新的糞菌保存方法，能在很大程度上推動(dòng)糞菌樣本庫的建立和糞菌移植的臨床應(yīng)用。