江濤 陳琳 王雪野

【摘要】 目的 研究外周血雙陰（double positive， DN）T細(xì)胞在自身免疫性疾病患者的分布特點(diǎn)， 以及自身免疫性疾病患者經(jīng)過(guò)免疫治療后DNT細(xì)胞的變化情況。方法 選擇首次確診未經(jīng)治療的38例自身免疫性疾病患者作為治療前組， 經(jīng)過(guò)激素和或激素聯(lián)合免疫抑制劑治療后滿4周的13例自身免疫性疾病患者作為治療后組， 同期30例健康體檢者作為對(duì)照組。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組研究對(duì)象的外周血DNT細(xì)胞含量， 比較三組研究對(duì)象外周血DNT細(xì)胞含量。結(jié)果 治療前組患者外周血DNT細(xì)胞含量為（4.93±2.78）%， 高于對(duì)照組的（3.90±1.90）%， 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;治療后組患者外周血DNT細(xì)胞含量為（2.20±0.80）%， 低于治療前組的（4.93±2.78）%， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 自

身免疫性疾病患者外周血DNT細(xì)胞含量高于健康人群， 說(shuō)明DNT細(xì)胞有免疫促進(jìn)作用， 自身免疫性疾病患者經(jīng)過(guò)免疫治療后DNT細(xì)胞較治療前明顯下降， 說(shuō)明DNT細(xì)胞參與下調(diào)免疫反應(yīng)的作用。

【關(guān)鍵詞】 自身免疫性疾病;雙陰T 細(xì)胞

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.33.110

Expression and significance of peripheral blood DNT cells in autoimmune diseases ? JIANG Tao， CHEN Lin， WANG Xue-ye， et al. Jilin Peoples Hospital， Changchun 130021， China

【Abstract】 Objective ? To study the distribution characteristics of double negative （DN） T cells in peripheral blood in patients with autoimmune diseases and the changes of DNT cells in patients with autoimmune diseases after immunotherapy. Methods ? There were 38 patients with autoimmune diseases diagnosed for the first time without treatment selected as the pre-treatment group， 13 patients with autoimmune diseases after 4 weeks of treatment with hormone or hormone combined immunosuppressant selected as the post-treatment group， and 30 healthy persons in the same period as the control group. Flow cytometry was used to detect the content of DNT cells in the peripheral blood of the three groups， and the content of DNT cells in the peripheral blood of the three groups was compared. Results ? The content of DNT cells in the peripheral blood in pre-treatment group was （4.93±2.78）%， which was higher than （3.90±1.90）% in the control group， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. The content of DNT cells in the peripheral blood in post-treatment group was （2.20±0.80）%， which was lower than （4.93±2.78）% in pre-treatment group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion ? The content of DNT cells in the peripheral blood of the patients with autoimmune diseases is higher than that of the healthy people， which indicates that DNT cells have immune promoting effect. After immunotherapy， DNT cells in the patients with autoimmune diseases are significantly lower than that before treatment， which indicates that DNT cells participate in the down-regulation of immune response.

【Key words】 Autoimmune diseases; Double negative T cell

近期研究發(fā)現(xiàn)， 機(jī)體內(nèi)存在著一種T細(xì)胞亞群， 這種亞群不同以往的CD4+和CD8+T細(xì)胞的， 這類細(xì)胞命名為CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞， 即DNT細(xì)胞。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明DNT細(xì)胞存在于健康人群體內(nèi)， 以及正常小鼠體內(nèi)[1-4]。DNT細(xì)胞與免疫調(diào)節(jié)、自身免疫性疾病、器官移植排斥反應(yīng)及腫瘤免疫耐受密切相關(guān)[5， 6]。其中自身免疫性疾病是指機(jī)體針對(duì)自身抗原而發(fā)生的免疫反應(yīng)， 從而使自身組織發(fā)生了損害的一種疾病。包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、干燥綜合征（SS）、強(qiáng)直性脊柱炎（AS）、白塞氏?。˙D）等。在我國(guó)王紅霞等[8]做了關(guān)于24例RA患者外周血DNT細(xì)胞的檢測(cè)， 同時(shí)也對(duì)DNT細(xì)胞表面的 FAS受體相關(guān)表達(dá)做了研究， 結(jié)果表明DNT細(xì)胞以及其表面的FAS受體表達(dá)明顯增加， 提示RA的發(fā)病機(jī)制中DNT細(xì)胞起到一定作用。SLE患者外周血中DNT細(xì)胞有著明顯的升高[7]， 甚至在SLE患者炎癥器官受累中， 產(chǎn)生了大量白細(xì)胞介素-17（IL-17）， 與SLE的發(fā)病被認(rèn)為相關(guān)。袁偉等[9]檢測(cè)了AS患者外周血DNT細(xì)胞水平明顯高于健康人群的對(duì)照組， 提示AS患者體內(nèi)發(fā)生了細(xì)胞免疫紊亂， AS的發(fā)生發(fā)展與T細(xì)胞亞群的失衡可能有關(guān)。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)自身免疫系統(tǒng)疾病患者首次確診（治療前）和治療后及健康人進(jìn)行了外周血DNT細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)， 旨在探討DNT在自身免疫性疾病中的表達(dá)與意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取吉林省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2014年

1月～2016年8月收治的51例自身免疫性疾病患者作為疾病組， 所有入選的患者均符合最新的分類標(biāo)準(zhǔn)。其中RA 10例，

SLE 8例， AS 13例， BD 3例， SS 2例， 銀屑病關(guān)節(jié)炎4例， 結(jié)締組織病4例， 其他自身免疫性疾病7例;其中男19例， 女32例;年齡22～65歲， 中位年齡43.2歲;其中51例患者包括首次確診未經(jīng)治療的38例自身免疫性疾病患者作為治療前組， 經(jīng)過(guò)激素和或激素聯(lián)合免疫抑制劑治療后滿4周的13例自身免疫性疾病患者作為治療后組。選擇同期健康體檢者30例作為對(duì)照組， 其中男13例， 女17例;年齡20～64歲， 中位年齡40.5歲。

1. 2 試劑和儀器 抗-CD3單抗、抗-CD28單抗均購(gòu)自美國(guó)ebioscience公司;重組人白細(xì)胞介素（rhIL）-2、rhIL-4購(gòu)自美國(guó)PEPRPTECH公司;RosettesepCD4、負(fù)選試劑盒， Easysep CD4、CD8、CD56正選試劑盒。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司;CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE， CD3-FITC/CD56-PE， 購(gòu)自法國(guó)貝克曼公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自法國(guó)貝克曼公司。

1. 3 檢測(cè)方法 檢測(cè)外周血DNT：抽取清晨空腹患者和對(duì)照組健康人靜脈血2 ml， EDTA-K2抗凝， 標(biāo)本在6 h內(nèi)處理。按照檢測(cè)要求， 分別向編好的流式試管中加入20 μl單克隆抗體， 隨后加入混勻的100 μl抗凝血， 混勻， 避光， 室溫孵育15 min， 分別加入溶血?jiǎng)?溶解未標(biāo)記細(xì)胞及紅細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞儀， 檢測(cè)外周血CD3+CD4-CD8-， 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1. 4 觀察指標(biāo) 比較三組研究對(duì)象外周血DNT細(xì)胞含量。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

治療前組患者外周血DNT細(xì)胞含量高于對(duì)照組， 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;治療后組患者外周血DNT細(xì)胞含量低于治療前組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1， 圖1， 圖2。

3 討論

DNT細(xì)胞是T細(xì)胞的一種亞型細(xì)胞， 隨著人們對(duì)DNT細(xì)胞的深入研究， 很多人關(guān)注到了DNT細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)， 有報(bào)道顯示， 在SLE和RA等自身免疫性疾病中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)起了非常重要的作用[11， 12]。

Crispin等[13]的研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血中DNT細(xì)胞顯著升高， 并發(fā)現(xiàn)在狼瘡性腎炎（LN）的腎組織中DNT細(xì)胞明顯積聚， 而且還分泌了IL-17， 然而外周血中的DNT則分泌的是γ-干擾素（IFN-γ）， 這兩種細(xì)胞因子都參與了SLE患者腎臟炎癥的發(fā)生發(fā)展。Zhang等[14]也發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)IL-23R

與IL-17的DNT細(xì)胞在SLE的鼠模型中， 并且發(fā)現(xiàn)這個(gè)濃度與疾病的嚴(yán)重程度有正相關(guān)性。Kyttaris等[15]用IL-23R處理小鼠淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞給缺陷小鼠輸注了這種DNT細(xì)胞后， 引發(fā)了小鼠狼瘡樣腎炎發(fā)生。免疫細(xì)胞比例失衡在自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用， 為將來(lái)自身免疫性疾病應(yīng)用生物治療提供了非常重要的理論基礎(chǔ)[16]。本實(shí)驗(yàn)研究治療前組患者外周血DNT細(xì)胞含量為（4.93±2.78）%， 高于對(duì)照組的（3.90±1.90）%， 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;說(shuō)明自身免疫性疾病患者外周血DNT細(xì)胞含量升高， 與對(duì)照組雖然無(wú)差異， 但說(shuō)明DNT細(xì)胞有免疫反應(yīng)促進(jìn)作用。且本次實(shí)驗(yàn)顯示：治療后組患者外周血DNT細(xì)胞含量為（2.20±

0.80）%， 低于治療前組的（4.93±2.78）%， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 說(shuō)明DNT具有下調(diào)免疫反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)， 與健康對(duì)照組相比， 自身免疫性疾病患者中DNT細(xì)胞含量升高， 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 可能與疾病的病種多樣性有關(guān)， 各個(gè)免疫疾病的發(fā)病機(jī)制不盡相同， 故在今后研究中需要進(jìn)一步細(xì)化自身免疫性疾病的病種， 可能會(huì)帶來(lái)更有價(jià)值的結(jié)論。

隨著人們對(duì)DNT細(xì)胞研究的進(jìn)一步深入研究， 對(duì)DNT細(xì)胞的了解和認(rèn)識(shí)也將越來(lái)越豐富， 應(yīng)進(jìn)一步研究在不同疾病在發(fā)病、進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸過(guò)程中， 相關(guān)的基因突變及細(xì)胞因子的表達(dá)， 還有對(duì)藥物反應(yīng)等方面的變化情況， 以期深入推動(dòng)更多疾病的免疫治療以造?；颊撸?造福人類。

綜上所述， 自身免疫性疾病患者外周血DNT細(xì)胞含量高于健康人群， 說(shuō)明DNT細(xì)胞有免疫促進(jìn)作用， 自身免疫性疾病患者經(jīng)過(guò)免疫治療后DNT細(xì)胞較治療前明顯下降， 說(shuō)明DNT細(xì)胞參與下調(diào)免疫反應(yīng)的作用。

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[收稿日期：2019-06-06]