趙 海， 李 曦， 張 莉， 武 帥， 張永強(qiáng)， 李 軍， 張格祥， 楊丹鳳△

(1. 蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000； 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050； 3. 中國(guó)人民解放軍32110部隊(duì)衛(wèi)生連， 黑龍江 黑河 164300)

舒適的溫度對(duì)于人體維持健康至關(guān)重要，極端環(huán)境會(huì)影響人類健康。寒冷刺激會(huì)影響人類心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)[1-3]，已有研究表明冷環(huán)境造成人體諸多不適，并導(dǎo)致較高的住院率[4, 5]。有研究表明寒冷可以對(duì)雌性大鼠動(dòng)情周期造成影響[6]，但寒冷影響動(dòng)情周期的研究依然較少，機(jī)制尚不清楚。因此，建立寒冷所致動(dòng)情周期紊亂模型對(duì)于研究動(dòng)情周期健康顯得尤為重要。本研究通過建立寒冷對(duì)C57BL/6雌性小鼠動(dòng)情周期的影響的模型，初步探討其可能的機(jī)制，為預(yù)防寒冷可能帶來的生殖傷害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)健康雌性C57BL/6小鼠12只，體重(17～20)g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)溫度(23±1)℃，12 h/12 h晝夜交替，自由攝食攝水。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

微量加樣器、載玻片、生理鹽水、95%乙醇、HE染液、4%水合氯醛溶液、ELISA試劑盒(英國(guó)Biorbyt公司)、酶標(biāo)儀(SpectraMax M5)、低溫離心機(jī)(Centrifuge 5417R)。

1.3 動(dòng)物分組與處理

陰道細(xì)胞學(xué)涂片法觀察每只小鼠的動(dòng)情狀況，一周后將動(dòng)情周期均正常的12只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低溫組各6只。每?jī)商旆Q量一次體重。將低溫組小鼠每籠(460 mm×300 mm×160 mm)兩只放入(4±0.5)℃無風(fēng)的低溫艙中，每日4 h(10:30～14:30)。將對(duì)照組小鼠用同樣的方法置于常溫動(dòng)物房飼養(yǎng)。連續(xù)冷暴露2周，全部于動(dòng)情間期(涂片中全部是白細(xì)胞)處死，取子宮和卵巢置于-80℃冰箱，血液經(jīng)心臟取血后離心機(jī)3 000 r/min離心15 min后吸取血清分裝后置于-80℃冰箱。ELISA試劑盒檢測(cè)血清性激素水平，子宮和卵巢做病理分析。

1.4 動(dòng)情周期觀察

陰道細(xì)胞學(xué)檢查[6]。每日上午9點(diǎn)，用移液槍吸取適量生理鹽水后打入小鼠陰道并抽吸數(shù)次，涂于載玻片一端，晾干后用95%乙醇固定15 min，HE染色15 min后通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，判斷每只小鼠所處的動(dòng)情周期。

1.5 臟器系數(shù)的計(jì)算

1.6 性激素水平的測(cè)定

用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)每只小鼠血清雌二醇(estradiol, E2)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、孕酮(progesterone, P)和催乳素(prolactin, Prl)水平，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.7 組織病理學(xué)檢查

將剔除周圍脂肪及結(jié)締組織的子宮和卵巢立即投入4%多聚甲醛組織固定液中固定，經(jīng)過脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色、封片后，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 寒冷對(duì)小鼠動(dòng)情周期的影響

小鼠動(dòng)情周期一般為(4～5)d，包括動(dòng)情前期(Proestrus)1 d、動(dòng)情期(Estrus)1 d、動(dòng)情后期(Metestrus)1 d和動(dòng)情間期(Diestrus)1～2 d(圖1)。HE染色后光鏡下觀察，細(xì)胞清晰可見，周期容易辨別。與對(duì)照組小鼠相比，低溫組小鼠動(dòng)情間期顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，其余各期未見顯著性差異(表1)。

Fig.1Microphotographs of cellular characteristics for the identification of the estrous stage (HE100)

A: Proestrus; B: Estrus; C: Metestrus; D: Diestrus

2.2 寒冷對(duì)小鼠體重和子宮臟器系數(shù)的影響

在動(dòng)物建模過程中，各組小鼠行為活動(dòng)無異常。在實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)兩組小鼠在體重上沒有顯著性差異(P>0.05，圖2)。與對(duì)照組相比，低溫組小鼠子宮臟器系數(shù)明顯較低(P<0.01，表1)。

Fig.2Effects of cold exposure on body weight gain (n=6)

2.3 寒冷對(duì)小鼠血清性激素水平的影響

與對(duì)照組相比，低溫組小鼠血清FSH明顯升高(P<0.01)，低溫組小鼠血清Prl明顯降低(P< 0.01)。血清E2、LH、P水平尚未見差異(P>0.05，表2)。

2.4 寒冷對(duì)小鼠子宮和卵巢組織病理學(xué)的影響

對(duì)照組小鼠子宮整體結(jié)構(gòu)正常，腔壁結(jié)構(gòu)各層完整清晰，上皮細(xì)胞呈單層柱狀，排列整齊，全層未見充血水腫，箭頭所示為子宮腺管，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3A)。低溫組小鼠子宮上皮細(xì)胞排列紊亂，組織可見子宮腺管極度擴(kuò)張，如圖箭頭所示，未見充血水腫，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3B)。

對(duì)照組小鼠卵巢整體結(jié)構(gòu)正常，卵母細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，透明帶光滑，周邊顆粒細(xì)胞排列有序，組織未見明顯出血壞死，箭頭所示為卵泡，組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3C)。低溫組小鼠卵巢整體結(jié)構(gòu)正常，卵母細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，透明帶光滑，組織可見卵泡數(shù)量明顯減少，箭頭所示為黃體，組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3D)。

Tab. 1 Effects of cold exposure on estrous cycle and coefficient of uterus n=6)

**P<0.01vscontrol group

Tab. 2 Serum levels of E2, FSH, LH, P and Prl n=6)

E2: Estradiol; FSH: Follicle-stimulating hormone; LH: Luteinizing hormone; P: Progesterone; Prl: Prolactin

**P<0.01vscontrol group

Fig.3Morphological characteristics of uterus and ovary (HE100)

A: Control group uterus; B: Cold group uterus; C: Control group ovary; D: Cold group ovary

3 討論

寒冷作為一種環(huán)境因素可以對(duì)機(jī)體生殖功能產(chǎn)生影響[8]。本實(shí)驗(yàn)從體重、子宮臟器系數(shù)、血清激素水平和子宮、卵巢組織病理學(xué)等方面進(jìn)行了研究。有研究顯示寒冷可使冷暴露組雌性小鼠體重明顯低于對(duì)照組[9]，本研究中兩組小鼠體重?zé)o顯著差異。子宮臟器系數(shù)能反映寒冷對(duì)子宮重量的影響，與對(duì)照組小鼠相比，低溫組小鼠子宮臟器系數(shù)明顯較低，結(jié)合子宮組織病理學(xué)檢查結(jié)果，冷暴露對(duì)子宮實(shí)質(zhì)造成了損傷，以子宮上皮細(xì)胞排列紊亂和子宮腺管擴(kuò)張為主。由此推測(cè)寒冷造成小鼠動(dòng)情周期改變的原因可能與子宮損傷有關(guān)。

動(dòng)情周期可以作為體內(nèi)激素水平變化或生殖器官如子宮和卵巢變化的指征[10]。動(dòng)情前期雌激素水平最低，上皮細(xì)胞增殖緩慢，脫落細(xì)胞為有核上皮細(xì)胞；動(dòng)情期雌激素水平到達(dá)高峰，刺激陰道上皮增殖，大量無核角化細(xì)胞脫落；動(dòng)情后期屬于過渡期，三種細(xì)胞均可見[11,12]；動(dòng)情間期雌激素水平較低，孕激素水平較高，白細(xì)胞數(shù)量增多，可保護(hù)機(jī)體免受微生物感染[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低溫組小鼠在冷刺激后呈現(xiàn)明顯的動(dòng)情周期改變，主要表現(xiàn)為間期延長(zhǎng)。有研究表明，冷暴露能夠改變雌性大鼠的動(dòng)情周期，冷暴露后的雌性大鼠的動(dòng)情期和動(dòng)情間期明顯延長(zhǎng)[6]，與本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相近。還有研究顯示動(dòng)情周期的不規(guī)則性可能與雌性小鼠的卵泡發(fā)育異常有直接的關(guān)系[14]，本實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果顯示卵泡數(shù)量明顯減少，提示寒冷可能造成卵泡發(fā)育異常，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)情周期改變。因?yàn)橹芷谧兓莿?dòng)態(tài)連續(xù)的過程，所以每只小鼠所處周期的具體時(shí)間難以精確計(jì)算，陰道細(xì)胞學(xué)檢查方法仍具有局限性。

血中雌激素水平的變化是反應(yīng)周期變化的重要指征。E2由卵巢內(nèi)卵泡的顆粒細(xì)胞分泌，主要生理功能為促使子宮內(nèi)膜增生和增強(qiáng)子宮平滑肌收縮。FSH是垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的一種激素，主要生理功能為促進(jìn)卵泡成熟。LH由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌，它作用于成熟的卵泡，能引起排卵并生成黃體，在有FSH存在下，與其協(xié)同作用，刺激卵巢雌激素分泌，使卵泡成熟與排卵[15]。Prl為腺垂體分泌的一種蛋白質(zhì)激素，其對(duì)乳腺的作用主要為促進(jìn)乳腺發(fā)育生長(zhǎng)，引起并維持泌乳。P是卵巢分泌的具有生物活性的主要孕激素，可保護(hù)子宮內(nèi)膜，與雌激素具有協(xié)同作用。這些激素對(duì)于維持子宮和卵巢內(nèi)環(huán)境起著重要作用。本次實(shí)驗(yàn)低溫組小鼠FSH高于對(duì)照組，提示寒冷可能使垂體前葉分泌FSH增加，進(jìn)一步使得動(dòng)情周期延長(zhǎng)。性激素分泌受下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控，互相影響且較為復(fù)雜。有研究表明冷暴露能夠引起雌性大鼠生殖激素受體表達(dá)在分子水平上的破壞，動(dòng)情周期改變可能與子宮損傷有關(guān)[6]。

綜上所述，寒冷可致小鼠血清激素水平和子宮、卵巢組織發(fā)生改變，動(dòng)情周期延長(zhǎng)，進(jìn)而影響生殖功能，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。