許興哲 李延海 ，2，3

1生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點實驗室，西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，健康與康復(fù)科學(xué)研究所（西安 710049）

2國家醫(yī)療保健器具工程技術(shù)研究中心（廣州 510500）

3神經(jīng)功能信息學(xué)與康復(fù)工程民政部重點實驗室（西安 710049）

大腦新皮層（neocortex）結(jié)構(gòu)被認為與腦的高級認知功能如學(xué)習(xí)、記憶、注意、思維等息息相關(guān)，其相關(guān)神經(jīng)機制研究已受到廣泛關(guān)注。哺乳動物大腦新皮層具有典型的六層結(jié)構(gòu)，不同層具有不同的細胞構(gòu)筑、纖維聯(lián)系和生理功能。新皮層的Ⅰ層位于皮層的表面，軟腦膜下方，其神經(jīng)元密度遠低于Ⅱ～Ⅵ層[1]。研究發(fā)現(xiàn)，枕葉初級視皮層（V1）單眼區(qū)域（Oc1M區(qū)）面積1 mm2的神經(jīng)元柱平均含有71600個神經(jīng)元，其中Ⅰ層神經(jīng)元的數(shù)量僅為600，并且Ⅰ層中幾乎不含有錐體神經(jīng)元，這使得對Ⅰ層神經(jīng)元特性及功能的研究變得十分困難[2，3]。然而新皮層Ⅰ層是樹突和軸突十分密集的區(qū)域，這表明Ⅰ層神經(jīng)元可以接受大量的信號傳入。實驗發(fā)現(xiàn)，初級視皮層（V1）區(qū)域的Ⅰ層神經(jīng)元可以接受來自初級聽皮層和前額葉扣帶回等多個腦區(qū)的信號傳入[4，5]。同時，V1的Ⅰ層神經(jīng)元能夠通過一種自上而下的調(diào)節(jié)方式對Ⅱ/Ⅲ層或更深層的神經(jīng)元進行調(diào)制，這種調(diào)制作用能夠影響同一神經(jīng)元柱或多個臨近的神經(jīng)元柱[6]。由此可見，Ⅰ層神經(jīng)元在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能的實現(xiàn)中有著極為重要的信息調(diào)制作用。事實上，Ⅰ層所有神經(jīng)元都是中間神經(jīng)元，且多為GABA（γ-氨基丁酸）能抑制性神經(jīng)元，其功能是在皮層內(nèi)形成局部抑制回路，調(diào)制神經(jīng)信息傳遞[7]。已有實驗證實，Ⅰ層抑制性神經(jīng)元能夠通過抑制Ⅱ/Ⅲ層的抑制性神經(jīng)元而形成去抑制效果來特異性增強錐體神經(jīng)元的運動方向選擇性[8]。此外，實驗還發(fā)現(xiàn)Ⅰ層中間神經(jīng)元之間存在化學(xué)性突觸和電突觸共存的現(xiàn)象，相同類型的Ⅰ層神經(jīng)元之間普遍存在電耦合現(xiàn)象，這與大腦的注意功能和認知活動密切相關(guān)[9]。雖然此前已有研究提出Ⅰ層神經(jīng)元從形態(tài)上分為單束細胞（single bouquet cells，SBCs）和細長的神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞（elongated neurogliaform cells，ENGCs）兩大類[10，11]，但是到目前為止，尚未見視覺發(fā)育可塑性關(guān)鍵期內(nèi)Ⅰ層神經(jīng)元電學(xué)特性及其分類的研究報道。本研究采用腦片膜片鉗全細胞記錄技術(shù)，在急性分離大鼠視皮層腦片標本上，探討初級視皮層（Oc1M區(qū)）Ⅰ層中間神經(jīng)元的被動和主動電學(xué)特性，以及動作電位（action potential，AP）的發(fā)放特征，并根據(jù)其電學(xué)特性進行分類，為進一步了解不同類型的Ⅰ層神經(jīng)元功能及其在視覺信息處理中的作用提供背景性資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗使用健康的SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠30只，鼠齡為13～15天，由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 視皮層腦片制備與孵育

采用常規(guī)方法制備大鼠視皮層腦片標本，每只大鼠取單側(cè)視皮層組織，制備2個腦片[12]。即大鼠乙醚麻醉后，迅速斷頭取腦置于冰冷（0～4℃）的、95%O2和5%CO2混合氣飽和并持續(xù)通氣的人工腦脊液（Artificial cerebro-spinal fluid，ACSF）中。ACSF離子成分及濃度 （mmol/L）：NaCl 120，KCl 2，KH2PO41.2，MgCl2·6H2O 1.2，CaCl22.5，NaHCO326，Glucose 11（pH=7.4，滲透壓為300～310 mOsm/kg·H2O）。對腦組織進行修塊處理后，使用振動切片機（美國WPI公司，NVSLM1）對含有視皮層Oc1M區(qū)的腦組織塊進行冠狀切片，切成300 μm厚的腦片。將腦片置于O2/CO2混合氣飽和的ACSF孵育槽中孵育，在31℃下孵育30 min后，轉(zhuǎn)移到室溫（23℃）孵育30 min以上備用。

1.3 視皮層腦片膜片鉗全細胞記錄

將孵育后的腦片移至灌流槽，并將U形蓋網(wǎng)放置于腦片上方以防止腦片的移動。使用蠕動泵（美國WPI公司，PERIPRO-4LS）向灌流槽中持續(xù)灌流氧飽和的人工腦脊液，灌流速度為1.5～2.5 ml/min。使用直立式紅外微分干涉相差顯微鏡（日本尼康公司，F(xiàn)N1）確定腦區(qū)和選擇細胞，即在低倍物鏡下（×5），參照大鼠腦立體定位圖[13]找到大鼠視皮層Oc1M區(qū)Ⅰ層。然后切換到高倍浸水物鏡（×40）下，觀察Ⅰ層中間神經(jīng)元的形態(tài)，尋找邊界清楚、表面光滑且折光性強的細胞進行腦片膜片鉗實驗。使用玻璃微電極拉制儀（日本Narishige公司，PC-10）拉制記錄電極，電極阻抗為3～6 MΩ。電極內(nèi)液成分及其濃度（mmol/L）：葡糖酸鉀130，NaCl 5，MgCl22，CaCl20.1，EGTA 1，HEPES 10，Na2ATP 2，Na3GTP 0.25（pH=7.2，滲透壓為280～290 mOsm/kg·H2O）。通過膜片鉗放大器（美國Molecular Devices公司，700B）對膜電流或膜電位進行鉗制。通過數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器（美國Molecular Devices公司，1440A）進行采樣，采樣頻率為10k Hz，低通濾波3k Hz。數(shù)據(jù)的采集使用美國Molecular Devices公司的pCLAMP 10.3軟件。用于統(tǒng)計分析的實驗數(shù)據(jù)標準為串聯(lián)阻抗Ra小于25 MΩ，變化不大于10%，且動作電位幅值大于80 mV。

1.4 神經(jīng)元電學(xué)特性測量

在全細胞模式下，穩(wěn)定5 min后對神經(jīng)元的被動和主動電學(xué)特性進行測量。在電壓鉗模式下，鉗制細胞膜電位于-70 mV，通過pCLAMP軟件提供的膜測試功能讀取細胞膜電容（membrane capacitance，Cm）和膜時間常數(shù)（membrane time constant，Tau）等被動電學(xué)參數(shù)。對細胞施加步進的超極化電壓刺激，測量細胞對電壓響應(yīng)的I-V曲線，并計算其輸入阻抗（input resistance，Rin）。在電流鉗模式下，將細胞電流鉗制于0 pA，此時的膜電位即為靜息電位（resting potential，Vres）。之后施加持續(xù)時間為1 ms去極化方波步進電流刺激，以誘導(dǎo)單個動作電位的發(fā)生，觀察動作電位的波形、幅值、能夠誘發(fā)細胞產(chǎn)生動作電位臨界膜電位值的閾電位（threshold potentials，Vts）和動作電位后電位（after-potentials）等主動電學(xué)特性。神經(jīng)元興奮性的大小受閾電位（Vts）和靜息電位（Vres）的影響，閾電位與靜息電位之間的差值（Vts-Vres）記為神經(jīng)元的能障，其含義表示神經(jīng)元受到興奮性刺激產(chǎn)生動作電位所需的去極化程度。最后向細胞注入持續(xù)時間為1 s步進的去極化方波電流刺激，誘發(fā)神經(jīng)元連續(xù)發(fā)放動作電位，觀察神經(jīng)元動作電位的發(fā)放特征。

1.5 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學(xué)處理

實驗記錄到狀態(tài)良好的Ⅰ層神經(jīng)元共58例，其中后去極化神經(jīng)元19例，后超極化神經(jīng)元39例。共43例Ⅰ層神經(jīng)元能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的連續(xù)動作電位發(fā)放。使用Clampfit 10.3軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)使用均數(shù) ±標準誤來表示，采用獨立樣本t檢驗進行組間數(shù)據(jù)比較，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠初級視皮層Ⅰ層中間神經(jīng)元的分類

在電流鉗模式下，給予記錄神經(jīng)元持續(xù)時間為1 ms的單個去極化方波電流刺激，誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生單個動作電位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在視覺發(fā)育可塑性關(guān)鍵期內(nèi)，初級視皮層Ⅰ層神經(jīng)元后電位存在后去極化（after-depolarization，ADP）和后超極化（after-hyperpolarization，AHP）兩種類型，后去極化的幅度能夠達到15.11±3.02 mV；而后超極化的幅度為-6.22±0.53 mV。因此，根據(jù)動作電位的后電位不同將初級視皮層Ⅰ層神經(jīng)元區(qū)分為后去級化神經(jīng)元（after-depolarization neurons，ADPNs）和后超極化神經(jīng)元（after-hyperpolarization neurons，AHPNs）兩類（圖 1A 和圖 1B），其中ADPNs占初級視皮層Ⅰ層神經(jīng)元的32.8%（n=19），而AHPNs占所有視皮層Ⅰ層神經(jīng)元的67.2%（n=39，圖1C）。

圖1 兩類Ⅰ層中間神經(jīng)元的動作電位波形及其比例

2.2 兩類Ⅰ層中間神經(jīng)元的能障（energy b arrriieerr，VV ttss--VVrreess）比較

在電流鉗模式下，測得ADPNs和AHPNs的靜息電位分別為-61.84±0.79 mV與-55.40±1.00 mV，兩者間存在顯著性差異（P＜0.05，圖2A）；ADPNs的閾電位為-32.02±1.94 mV，AHPNs的閾電位為-37.69± 0.88 mV，兩者間亦存在顯著性差異（P＜0.05，圖2B）。之后進一步比較兩類細胞的能障，ADPNs的能障為29.80±2.07 mV，AHPNs的能障為17.10±1.14 mV，ADPNs與AHPNs能障相比具有顯著性差異（P＜0.05，圖2C），上述實驗結(jié)果表明，與AHPNs相比較，ADPNs具有較低的興奮性和較高的能障，需要更強的去極化刺激才能誘發(fā)其產(chǎn)生動作電位。

圖2 兩類Ⅰ層中間神經(jīng)元的靜息電位、閾電位和能障的比較

2.3 大鼠初級視皮層Ⅰ層中間神經(jīng)元的其他電學(xué)特性

基于上述視皮層Ⅰ層中間神經(jīng)元的分類，進一步統(tǒng)計這些神經(jīng)元的其他電學(xué)特性參數(shù)（表1）。結(jié)果表明，ADPNs和AHPNs的動作電位幅值分別為97.67±1.48 mV與92.10±1.10 mV，兩者間存在顯著性差異（P＜0.05）。而ADPN為-77.79 ± 3.94 mV/mS，AHPNs為-66.51±2.80 mV/mS，兩者間亦存在顯著性差異（P＜0.05）。而其膜電容、時間常數(shù)、輸入阻抗以及動作電位的最大上升斜率等參數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 ADPNs和AHPNs的電學(xué)特性

2.4 大鼠初級視皮層Ⅰ層兩類中間神經(jīng)元動作電位的發(fā)放特性

在電流鉗模式下，向大鼠視皮層Ⅰ層中間神經(jīng)元注入持續(xù)時間為1 s的去極化方波電流刺激，觀察兩類神經(jīng)元動作電位的發(fā)放特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著注入電流強度的增加，動作電位的發(fā)放頻率逐漸增加。在注入60 pA去極化刺激條件下，ADPNs第12個動作電位的瞬時發(fā)放頻率為24.38±2.20 Hz，AHPNs第12個動作電位的瞬時發(fā)放頻率為25.11±1.17 Hz，兩組間無顯著性差異（P＞0.05，n=43，圖3A和3B）。隨著兩類神經(jīng)元動作電位的連續(xù)發(fā)放，其動作電位發(fā)放均存在峰值的降低與半峰寬變大的現(xiàn)象，且兩組間存在顯著性差異（P＜0.05，n=43，圖3C和3D），進一步比較兩類神經(jīng)元第12個動作電位和第1個動作電位的幅值比和半峰寬比，結(jié)果顯示ADPNs動作電位幅值比和半峰寬比分別為0.99±0.01和1.49±0.05，而AHPNs動作電位幅值比和半峰寬比分別為0.96±0.004和 1.32±0.02，兩者均存在顯著性差異（P＜0.05，n=43，圖3A和3B）。此外，ADPNs與AHPNs動作電位的發(fā)放頻率也存在頻率適應(yīng)性現(xiàn)象[14]，ADPNs與AHPNs第12個動作電位與第1個動作電位的瞬時頻率比分別為0.65±0.04和0.87 ± 0.06（P＜0.05，n=43，圖3E）。

3 討論

大腦皮層Ⅰ層位于皮層的表面，由低密度的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、皮層錐體細胞的頂樹突以及其它新皮層區(qū)域和丘腦的軸突組成。Ⅰ層神經(jīng)元為抑制性中間神經(jīng)元，且95%以上為GABA能中間神經(jīng)元，可以直接抑制大腦皮層錐體細胞的頂樹突產(chǎn)生抑制效應(yīng)，也可以抑制其他抑制性中間神經(jīng)元產(chǎn)生去抑制效應(yīng)，因此，大腦皮層Ⅰ層神經(jīng)元通過抑制和去抑制兩種調(diào)控方式來上調(diào)和下調(diào)大腦皮層錐體神經(jīng)元的活動，進而對大腦皮層神經(jīng)元信號的正常傳遞、信息整合以及視覺注意功能等起著非常重要的調(diào)制作用[11]。本研究在SD大鼠初級視皮層Oc1M區(qū)Ⅰ層中間神經(jīng)元上，使用全細胞記錄技術(shù)探討了Ⅰ層中間神經(jīng)元電學(xué)特性。結(jié)果表明，大鼠視皮層Ⅰ層神經(jīng)元后電位存在ADP和AHP兩種類型。已有研究發(fā)現(xiàn)，ADP的產(chǎn)生與神經(jīng)元持續(xù)性鈉電流（persistent sodium current，INap）密切相關(guān)[15]；此外，KCNQ/M（Kv7）鉀通道亦參與了神經(jīng)元ADP的形成[16]。另有資料表明，AHP可能與鈣誘導(dǎo)的鈣釋放（CICR）有關(guān)，內(nèi)源性鈣離子的升高進一步激活鈣激活鉀通道，導(dǎo)致AHP的產(chǎn)生[17，18]。

圖3 兩類Ⅰ層中間神經(jīng)元動作電位發(fā)放特性的比較

基于后電位的特性的不同將視皮層I層中間神經(jīng)元分為ADPNs與AHPNs兩類。兩類神經(jīng)元間在靜息電位和閾電位上均存在顯著性差異，即ADPNs具有膜內(nèi)負電位值較大的靜息電位和和膜內(nèi)負電位較小的閾電位，而AHPNs具有膜內(nèi)負電位值較小的靜息電位和膜內(nèi)負電位值較大的閾電位，因此ADPNs比AHPNs具有更大的能障，上述結(jié)果表明AHPNs比ADPNs對興奮性刺激更加敏感，在受到相同去極化刺激時，AHPNs比ADPNs更容易爆發(fā)動作電位。此外，兩類神經(jīng)元在動作電位幅值等電學(xué)特性上亦存在顯著的差異，提示同類型的神經(jīng)元在神經(jīng)信息傳遞以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中具有不同的作用。

在神經(jīng)元注入一段去極化刺激后，神經(jīng)元誘發(fā)的動作電位發(fā)放頻率可能受到膜興奮性和后電位的調(diào)節(jié)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)兩類神經(jīng)元具有相似的平均發(fā)放頻率，ADPNs具有較低的興奮性和后去極化電位，而AHPNs具有較高的興奮性和后超極化電位，后超極化電位能夠降低神經(jīng)元在峰電位之后一段時間內(nèi)的興奮性，防止神經(jīng)元對刺激產(chǎn)生過高強度的響應(yīng)，因此，神經(jīng)元興奮性和后電位的共同影響導(dǎo)致了兩類神經(jīng)元具有相似的發(fā)放頻率。本研究還發(fā)現(xiàn)兩類神經(jīng)元具有不同的動作電位幅值以及峰展寬，提示兩類神經(jīng)元膜上可能具有不同的Na+通道和K+通道密度[15]。初級視皮層Ⅰ層兩類神經(jīng)元中廣泛存在頻率適應(yīng)性變化的情況，這些發(fā)放特性的不同，提示了兩類神經(jīng)元可能影響了不同的突觸微環(huán)路，發(fā)揮不同的功能，在局部神經(jīng)元回路中可能起到相互補充的作用[14]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ層的一些GABA能神經(jīng)元擁有軸突異位自發(fā)性放電的現(xiàn)象，這有利于神經(jīng)元對機體進行調(diào)控，對皮層進行信息整合存在一定的意義[19]。

4 總結(jié)

本實驗使用腦片膜片鉗全細胞記錄技術(shù)，在大鼠初級視皮層腦片標本上，探討Ⅰ層中間神經(jīng)元的被動和主動電學(xué)特性以及神經(jīng)元的發(fā)放特性。結(jié)果顯示，大鼠初級視皮層Ⅰ層存在后去極化神經(jīng)元和后超極化神經(jīng)元兩種類型，且二者的被動和主動電學(xué)特性以及發(fā)放特性具有顯著性差異。這些研究結(jié)果為進一步探討不同類型的Ⅰ層中間神經(jīng)元對深層神經(jīng)元的調(diào)控作用、對信息整合、運動視覺信息處理以及注意功能的實現(xiàn)機制提供了電生理學(xué)基礎(chǔ)。