柴詩語，郭靜，孟根其其格，馬瑞瑞，陳霞

（內蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點實驗室，內蒙古呼和浩特010018）

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）與人類生活密切相關，是一種常見于奶油、肉類中的乳酸菌，可定植在腸道發(fā)揮有益作用，在現(xiàn)代食品工業(yè)中可廣泛應用，常做為制作發(fā)酵乳制品中的發(fā)酵劑[1-2]。自從Whitehead 和Cox 等發(fā)現(xiàn)導致某些乳制品發(fā)酵失敗是由于發(fā)酵劑感染噬菌體病毒，發(fā)酵乳制品行業(yè)就試圖尋找持久的解決方案來控制噬菌體污染問題[4]。烈性噬菌體是一類能侵染且致死細菌的病毒，其生活周期包括吸附、注入、復制、裝配、釋放[3]。吸附是噬菌體侵染宿主菌的第一步。噬菌體顆粒與宿主細胞表面碰撞，通過特異性識別其受體并與之緊密結合，使吸附發(fā)生[3]。植物乳桿菌細胞壁具有典型的革蘭氏陽性菌結構，其受體成分可能為細胞壁上的多糖成分，包括磷壁酸、多層肽聚糖以及糖蛋白以及其他不同功能蛋白質[5]。一般采用基因誘導或自發(fā)突變等方法來獲取抗性菌株，但基因誘導會存在抗性菌株遺傳特性不穩(wěn)定等缺點。而自然環(huán)境中，乳酸菌會自我形成抗噬菌體防御機制，來抵抗環(huán)境中的噬菌體污染。宿主菌可通過改變噬菌體受體來阻止噬菌體吸附，如受體表達下調和空間阻遏，受體突變和丟失等[6-7]。所以采用模擬極端環(huán)境馴化敏感菌，使其快速生成抗性，以此替代敏感株作為發(fā)酵用菌是較為安全又穩(wěn)定的方法。

本試驗在含有噬菌體P2 環(huán)境中使敏感植物乳桿菌L.plantarum IMAU10120 自發(fā)突變，以獲得穩(wěn)定遺傳的抗噬菌體突變株。通過對比兩者的吸附率，判斷突變株的吸附受體是否發(fā)生改變，并分析不同生理狀態(tài)對噬菌體吸附能力的影響，研究噬菌體P2 的吸附受體。為培育抗性工程菌提供一定的理論基礎和數(shù)據(jù)支持，以降低工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中噬菌體污染的威脅，增加相關產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 敏感株及噬菌體

敏感株植物乳桿菌L.plantarum IMAU10120：分離自內蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭的自然發(fā)酵酸牛乳樣品，由內蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供；乳桿菌烈性噬菌體P2：分離自L.plantarum IMAU10120 的異常發(fā)酵液中，屬長尾噬菌體[8]。

1.1.2 試劑

牛肉膏、植物蛋白胨、葡萄糖、乙酸鈉、酵母粉、檸檬酸鈉、MgSO4、MnSO4、Tween-80、KH2PO4、Na2HPO4、CaCl2、NaCl、瓊脂、十二烷基硫酸鈉（均為分析純）：呼和浩特澤浩生物科技有限公司。

1.1.3 儀器

ZHJH-C1112 型無菌工作臺：上海智誠分析儀器制造有限公司；CP2202C 電子天平：上海奧豪斯儀器上海有限公司；EP pendorf 5810R 型高速臺式離心機：德國Hambury 公司；SP-650 型全自動干熱滅菌鍋：上海DVANTEC 立敏事業(yè)有限公司；HA-300MIII 型全自動高壓蒸汽滅菌器：日本HIRAYAMA 公司；雷磁PHSJ-3FpH 計：上海精密科學儀器有限公司；AL204 型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；EYELAWF0-700 型恒溫干燥箱：上海愛鵬儀器有限公司；HWS28型電熱恒溫水浴鍋：上海-恒科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 活化敏感菌

將保存的L.plantarum IMAU10120 按2%的接種量接種于20 mL 復原豆乳中，37 ℃培養(yǎng)24 h，凝乳后第二代再按2%的量接種于MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，傳至3 代，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 純化噬菌體

將2%L.plantarum IMAU10120 接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中后加入CaCl2使其終濃度達10 mmol/L，37 ℃培養(yǎng)至OD600≈0.5 后按感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為0.5 加入噬菌體P2 裂解液，37 ℃培養(yǎng)3 h~4 h 直至菌液澄清。9 230 r/min 離心5 min 去除沉淀，收集上清液經(jīng)0.22 μm 無菌濾膜過濾去除剩余菌體得到噬菌體懸液，按照雙層平板法（上層瓊脂0.7%，下層瓊脂1.5%）進行噬菌體純化。將噬菌體裂解液按濃度梯度稀釋，對不同稀釋梯度的噬菌體裂解液采用雙層平板法進行計數(shù)，37 ℃培養(yǎng)16 h~18 h，計數(shù)噬菌斑，測定效價。所得濾液即為噬菌體原液。放于4 ℃冰箱中儲存待用。

1.2.3 次級感染法篩選抗噬菌體菌株

采用次級感染的方法篩選植物乳桿菌自發(fā)突變抗噬菌體菌株。具體步驟如下：

1）敏感株按2 %接種量接至MRS-Ca 液體培養(yǎng)基，生長至OD600≈0.5；

2）按最佳感染復數(shù)接入噬菌體P2，37 ℃連續(xù)培養(yǎng)48 h；

3）將培養(yǎng)出的菌液涂布于MRS 平板之上，37 ℃連續(xù)培養(yǎng)48 h；

4）挑取單菌落，接種至MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃連續(xù)培養(yǎng)24 h；

5）將選育出的菌液3 次劃線培養(yǎng)純化；

6）將突變株株培養(yǎng)至含有P2 的MRS-Ca 培養(yǎng)基中，觀察生長情況。若此條件下，菌株10 d 內傳代正常，則判定該菌株為抗噬菌體菌株[9]。

1.2.4 抗噬菌體菌株的形態(tài)觀察

將L.plantarum IMAU10120 及純化后的抗噬菌體突變株分別接種于MRS 培養(yǎng)基中活化，多次10 倍稀釋后，于MRS 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃，連續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。并選取單個菌落于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)至對數(shù)期，取少量菌體用于革蘭氏染色，萊卡顯微鏡下觀察野生株和突變株間的形態(tài)差異。

1.2.5 噬菌體P2 對敏感菌株及突變株的吸附特性測定

根據(jù)Quiberoni 和Reinheimer 的試驗方法[7]，將敏感株與突變株分別以2%的接種量接至MRS-Ca 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期，然后加入噬菌體P2 按感染復數(shù)為0.5。對照組以只加同量噬菌體于無菌的MRS-Ca 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，培養(yǎng)30 min。后對照組與試驗組的培養(yǎng)液均經(jīng)9 230 r/min 離心5 min。通過雙層培養(yǎng)的方法測定梯度稀釋后上清液中未吸附的噬菌體，吸附率可通過對照組與試驗組上清液進行雙層培養(yǎng)后，噬菌斑之差與對照組噬菌斑的比值計算。

1.2.6 細胞生理狀態(tài)對吸附的影響

通過測定培養(yǎng)環(huán)境中未吸附的噬菌體數(shù)來檢測活細胞和非活細胞對吸附的影響。將野生株與突變株按2%接種至MRS 液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至OD600≈0.5 后，100 ℃沸水10 min 滅活IMAU10120 及突變株，通過平板計數(shù)檢查其細胞的存活性，獲得100%死亡的細胞，進行吸附率檢測。對照組為噬菌體P2 吸附活的敏感株與突變株的效果。按感染復數(shù)0.5 加入噬菌體P2，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min 后，對照組與試驗組的培養(yǎng)液均經(jīng)9 230 r/min 離心5 min。稀釋上清液中未吸附的噬菌體，并通過雙層培養(yǎng)的方法測定，空白組為只添加噬菌體的液體培養(yǎng)基，計算吸附率[9]。

1.2.7 植物乳桿菌噬菌體P2 吸附受體測定

1.2.7.1 細胞壁的制備

將普通制備細胞壁方法優(yōu)化[10]

1）將植物乳桿菌野生株與突變株在MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別生長至OD600為0.5～0.8；

2）將液體4 615 r/min 離心5 min，除去上清液；

3）沉淀用10 mmol/L 的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH6.8）緩沖溶液洗滌兩次并離心（13 523 r/min，10 min）；

4）以1 ∶1（體積比）的比例加入玻璃珠（直徑為0.10 mm～0.15 mm）。然后將混合物渦旋振蕩45 min，在此期間將懸浮液每30 s 在冰浴中冷卻；

5）通過萊卡顯微鏡觀察及MRS 平板涂布37 ℃培養(yǎng)的方法，檢測菌體的存活情況及細胞破壞的效率；

6）連續(xù)4 次沉降（4 ℃，2 h）除去玻璃珠，并收集上清液；

7）5 652 r/min 離心10 min 除去完整的細胞及細胞碎片；

8）13 523 r/min 離心15 min 沉淀細胞壁并重懸于50 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.5）中，用DNA 酶（0.10 mg/mL）和RNA 酶（0.15 mg/mL）處理細胞壁，在37 ℃下作用30 min；

9）13 523 r/min 離心15 min 收集細胞壁，并在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）鹽緩沖液中連續(xù)重懸浮洗滌10 次；

10）最后通過上述的離心純化細胞壁，并在20 ℃下儲存。

1.2.7.2 細胞壁吸附測試

分別把不同濃度的100 μL 的IMAU10120 野生株及突變株的細胞壁與100 μL 噬菌體P2 裂解液（106pfu/mL）混勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱，吸附30 min；13 523 r/min 離心5 min，對上清液中未被吸附的噬菌體數(shù)進行檢測，計算吸附率，以獲得的細胞壁濃度具有最佳吸附率。（以吸附率高于90%的細胞壁濃度為噬菌體吸附的最佳細胞壁濃度）[11]。

1.2.7.3 細胞壁的化學和酶處理

將最佳濃度的突變株與敏感株的細胞壁懸浮液置于50 mmol/L 的Tris-HC（lpH7.5）中。分別與十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（1 %），溶菌酶（50 U/mL）和蛋白酶K（0.10 mg/mL）在37 ℃下處理30 min；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）（5%）在100 ℃下處理15 min。處理后的細胞壁用10 mmol/L 的PBS（pH 6.8）緩沖液連續(xù)洗滌5 次，13 523 r/min 離心5 min 收集細胞壁。測定處理后細胞壁的噬菌體吸附率，與未處理的細胞壁進行對照[11-12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的數(shù)據(jù)菌使用9.1 Origin lab 和Microsoft Excel 2016 數(shù)據(jù)分析軟件進行作圖分析。獨立試驗均重復進行3 次以上。并且使用IBM SPSS Statistics 20 以顯著性水平為0.05 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P＜0.05 為顯著，P＞0.05 為不顯著。

2 結果與分析

2.1 抗噬菌體菌株篩選結果

將保藏的L.plantarum IMAU10120 經(jīng)3 代活化后，在含有噬菌體P2 的環(huán)境下可生長的為自發(fā)突變抗噬菌體植物乳桿菌，經(jīng)3 次劃線純化后獲得10 株正常生長的菌株，再經(jīng)噬菌體富集環(huán)境下連續(xù)10 d 培養(yǎng)，在MRS 培養(yǎng)基中有8 株菌表現(xiàn)出穩(wěn)定的遺傳抗性，可正常生長。確定具有抗性的植物乳桿菌被稱為噬菌體不敏感突變株（bacteriophage-insensitive mutants，BIMs）。選擇抗噬菌體能力最強的一株進行研究。菌株在含有噬菌體P2 環(huán)境下生長結果見圖1。

圖1 噬菌體存在條件下強抗噬菌體突變株的生長情況Fig.1 The growth of mutant with strong resistance to phage under phage existence condition

2.2 抗噬菌體菌株形態(tài)觀察

敏感株與突變株菌落形態(tài)見圖2。

圖2 L.plantarum IMAU10120 及突變株的菌落形態(tài)圖Fig.2 The colony morphology of L.plantarum IMAU10120 and resistant strain

如圖2 所示，IMAU10120 及抗噬菌體菌株的菌落均為凸起、呈圓形、表面光滑、邊緣整齊、乳白色。

敏感株與突變株經(jīng)革蘭氏染色后顯示的細胞形態(tài)見圖3。

圖3 L.plantarum IMAU10120 及突變株的細胞形態(tài)圖Fig.3 The cellular morphology of L.plantarum IMAU10120 and resistant strain

如圖3 所示，經(jīng)革蘭氏染色，細菌呈藍紫色，證明野生株與突變株均為革蘭氏陽性菌，為直短桿狀，單個、成對或呈鏈狀排列。L.plantarum IMAU10120 與其噬菌體突變株的菌落和細胞形態(tài)相比較無明顯區(qū)別。

2.3 植物乳桿菌敏感株與突變株吸附特性比較分析

噬菌體P2 對敏感株與突變株的吸附效果見圖4。

圖4 L.plantarum MAU10120 及其噬菌體突變株吸附率Fig.4 The adsorption ratio of L.plantarum IMAU10120 and resistant strain

將L.plantarum IMAU10120 和突變株分別與噬菌體P2 混合在MRS-Ca 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)30 min，比較兩者對噬菌體P2 吸附特性的差異，結果如圖4所示。噬菌體P2 對敏感菌株和抗噬菌體突變株的吸附率在97%～98%，且無顯著差異（P＞0.05）。由此可以看出，突變株沒有抑制噬菌體吸附的現(xiàn)象，其吸附受體未發(fā)生改變。

2.4 細胞生理狀態(tài)對噬菌體P2 吸附能力的影響

敏感株與突變株在不同生理狀態(tài)對噬菌體P2 吸附能力影響見圖5。

圖5 不同生理狀態(tài)野生株與突變株的吸附率Fig.5 Adsorption rate of sensitive strains and mutants in different physiological states

L.plantarum IMAU10120 與突變株的活菌和非活菌與噬菌體P2 混合經(jīng)37 ℃培養(yǎng)30 min 后，結果如圖5 顯示：超過96%的噬菌體在不同生理狀態(tài)的敏感株與突變株的細胞上孵育30 min 后被吸附。敏感株與突變株的死細胞與活細胞的結果均無明顯差異。存活野生株與突變株的吸附率分別為（97.44±0.96）%，（97.60±1.01）%，而死亡菌株的吸附率分別為（97.39±1.09）%和（96.87±0.26）%，無顯著差異（P＞0.05）。突變株與敏感株的細胞生理狀態(tài)對于噬菌體P2 吸附功能無明顯影響。

2.5 噬菌體P2 吸附受體測定

L.plantarum IMAU10120 細胞經(jīng)機械破壁破碎后情況見圖6。

圖6 細胞破壁情況Fig.6 Cell wall breaking

植物乳桿菌為革蘭氏陽性菌，細胞壁結構包括磷壁酸、肽聚糖和其他蛋白質，故采用玻璃珠破壁法反復4 次震蕩、冰浴、沉降后，將破碎的細胞壁經(jīng)革蘭氏染色。通過圖6 所示，觀察植物乳桿菌突變株破碎情況，鏡下顯示無完整形態(tài)細胞壁。并通過平板劃線法驗證，48 h 內無菌落生長，表明突變株均全部死亡。

敏感株與突變株細胞壁經(jīng)化學及酶法處理后經(jīng)噬菌體侵染結果見表1。

表1 噬菌體P2 對經(jīng)不同試劑處理的野生株及突變株細胞壁的吸附率Table 1 The adsorption ratio of wild strain and mutant strain cell wall by chemical and enzyme treatment

將破碎后的細胞壁經(jīng)化學和酶法處理結果如表1所示，分別用SDS（1%）及蛋白酶K 處理細胞壁后，噬菌體P2 對野生株與突變株的吸附率與空白組相較均無顯著差異（P＞0.05），吸附率處于93%～97%之間。而溶菌酶處理后則明顯降低了本試驗中噬菌體的吸附率，野生株的吸附率下降至（81.37±1.88）%，抗性菌株至（83.61±2.20）%。此外，三氯乙酸（5%）作用細胞壁后，噬菌體P2 與菌株的結合能力下降愈加明顯，突變株的吸附率下降了約64%，而敏感菌的吸附率僅為11%～12%。

3 討論

近幾年，發(fā)酵制品需求量日益增加，噬菌體是減弱發(fā)酵劑活性的主要因素之一。篩選出具有抗噬菌體能力的優(yōu)良菌株對于提高發(fā)酵效率，改善產(chǎn)品風味等具有重要的意義。2018 年齊蕊名等通過次級感染法選育出6 株具有穩(wěn)定抗性的抗噬菌體Lpla 植物乳桿菌突變株[13]。王慕華等通過自然選育法，分離了4 株（St1-4）兼具抗性及較好發(fā)酵性的非溶源性抗性菌[14]。國外將菌株的抗噬菌體性作為評價或篩選優(yōu)良發(fā)酵劑菌株的重要標準。2014 年Marco 等對植物乳桿菌（ATCC 8014）自發(fā)抗噬菌體（ATCC 8014-B1 和ATCC 8014-B2）突變菌株（M1）的生物學及益生特性進行了研究，突變株與敏感株具有相同的免疫應答[6]。本試驗同采用次級感染法，使L.plantarum IMAU10120 突變，獲得抗噬菌體P2 突變株。優(yōu)勢是由于自發(fā)突變不涉及基因工程改造，具有簡單、方便且低廉等特點?？膳嘤鼍哂休^強的遺傳穩(wěn)定性的商業(yè)替代株，應用于工業(yè)生產(chǎn)[15]。

通常噬菌體吸附在宿主細胞壁上完成初步侵染。本研究檢測了抗性產(chǎn)生原因是否有由于受體蛋白缺失導致，結果顯示：敏感株與突變株間吸附率無顯著性差異，且作用明顯。由此可以推斷噬菌體抗性的產(chǎn)生并不是由于突變株吸附位點發(fā)生改變。

細胞壁提取方法通常包括：低溫微納米破壁技術、機械破壁法、化學滲透法、高壓脈沖電場破壁法等[16-18]。本試驗利用玻璃珠機械破碎法，該方法簡單經(jīng)濟，適用于鏈球菌、乳桿菌、芽孢桿菌等[19]。但應先排除細胞生理狀態(tài)這一干擾項。本研究采用100 ℃沸水致死細胞，對比敏感株與突變株的非活與活細胞吸附動力學差異，結果證明細胞生理狀態(tài)基本不會影響噬菌體P2 的吸附能力。采用相同方法，Quiberoni 等對德氏乳桿菌（YAB、BYM、Ib3 和LL-H）研究時證明，吸附率同樣無顯著性差異，5 min 內超過98%的在不同生理條件下的細胞被吸附[11]。而德氏乳桿菌（Cb1）則顯示出相反結果?？赡苁羌毎?jīng)熱處理后，噬菌體（Cb1/342）受體位點發(fā)生解體或細胞生理狀態(tài)改變，缺乏細菌能量所致[10]。

自1994 年Valyasevi 發(fā)現(xiàn)化學和酶法（十二烷基硫酸鈉、溶菌酶、蛋白酶K 和三氯乙酸）處理細胞壁，可應用于受體鑒定以來，該方法逐步得到認可[12]。SDS（1%）可破壞蛋白質分子間的非共價鍵，除去細胞壁表面蛋白膜組分或與細胞質膜共價結合的蛋白質[10-12]。溶菌酶可水解不溶性粘多糖成為可溶性多肽，包括膜上錨定的脂磷壁酸結構或肽聚糖結構[20]。蛋白酶K 可水解蛋白質中的肽鏈連接[12]。TCA（5 %）可去除與肽聚糖相關的細胞壁中的可溶性成分（磷壁酸、多糖等）[12]。方偉探究保加利亞乳桿菌受體結果顯示，敏感株（KLDS1.1016 和KLDS1.1028）及突變株（BIM08和BIM02）經(jīng)蛋白酶K、SDS 處理后，噬菌體（phildb）吸附率未發(fā)生顯著變化。而溶菌酶、TCA 處理后敏感株和突變株的吸附率分別下降了50%～60%及10%～30%。說明噬菌體的吸附受體與肽聚糖連接的細胞壁聚合物相關[9]。同樣，Quiberoni 用SDS 和蛋白酶K 作用德氏乳桿菌（YSDY、Ab1、LB-Ib3）與突變株的細胞壁，發(fā)現(xiàn)噬菌體（BYM、YAB、Ib3、IB539）的吸附率均無顯著降低（P＞0.05），TCA 作用后吸附率降低至22%以下，而溶菌酶處理時，吸附率幾乎為0。原因可能是由于溶菌酶可溶解肽聚糖，TCA 可提取出革蘭氏陽性菌中與肽聚糖相關細胞壁聚合物[7]。結論與本試驗結果類似，突變株經(jīng)SDS、蛋白酶K 處理后，吸附率與空白組相差無異，而經(jīng)溶菌酶水解后，敏感株與突變株的吸附率分別下降了18.63%和16.39%，TCA 作用后，吸附率分別下降了88.28%，64.76%。由此可推測細菌上由肽聚糖連接的細胞壁聚合物（多糖或磷壁酸）為噬菌體P2 的吸附受體。

由于抗噬菌體菌株產(chǎn)生抑制性的原因有很多種，可因細胞結構改變、代謝途徑改變或由于被侵染后自發(fā)死亡[6]。孔健等通過克隆并分析乳酸乳球菌中限制和修飾酶基因LlaBIII 發(fā)現(xiàn)具有CRISPR 序列的乳酸乳球菌可有效防止噬菌體感染[21]。McGrath 等發(fā)現(xiàn)宿主菌乳酸乳球菌亞種c2 中的質粒pNP40 編碼的蛋白可阻止φc2 噬菌體DNA 注入[22]。本研究中突變株受體結構未改變，因此抗性機理可能是由于參與DNA 復制、轉錄、翻譯等相關基因及代謝調節(jié)等相關基因突變導致的，究其原因可能是：1）具有CRISPR（獲得性免疫）系統(tǒng)；2）阻止DNA 注入；3）質粒丟失；4）抑制蛋白質合成等[22-23]。所以未來可探究抗性菌的全基因組序列，從突變基因和代謝通路角度解釋其抗性機理。

4 結論

通過次級感染法使敏感株自發(fā)突變出1 株具有抗噬菌體P2 的植物乳桿菌突變株。其具有與敏感株無顯著性差異的吸附特性，證明受體結構未發(fā)生變化。且通過改變生理狀態(tài)，判斷出噬菌體P2 吸附特性不受菌株生理條件影響。且采用化學或酶法處理敏感株與突變株的細胞壁檢測出噬菌體的吸附受體可能與磷壁酸或磷壁酸-肽聚糖聚合物有關。知此特性，可為培育抗噬菌體性工程菌提供理論基礎和數(shù)據(jù)支持，以期降低工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中噬菌體污染的威脅，獲得更穩(wěn)定的相關產(chǎn)品。