馮永巍，汪振炯

（1.無錫市食品安全檢驗檢測中心，江蘇無錫214100；2.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇南京211171）

利用相對廉價的豬肉冒充牛羊肉的現(xiàn)象近年來偶有發(fā)生，不僅破壞了市場公平，而且也成為威脅食品安全的重要隱患[1]。為了有效識別肉類摻假行為，建立一套高效、準確摻假鑒別方法，從肉制品中識別出豬源性成分是十分必要的。國內(nèi)外的研究以豬肉蛋白、豬DNA 為檢測指標建立了一些豬源性成分的檢驗方法[2-15]。其中以（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)為代表的核酸檢測技術(shù)以其檢測的準確性高，靈敏度高，抗干擾強等優(yōu)點得到了研究人員的廣泛接受[16-21]，但也存在設(shè)備昂貴、操作繁瑣、對操作人員要求高等缺點，推廣和應(yīng)用仍存在一定的局限性。

基于膠體金的可視化檢測為豬源性成分摻假鑒定提供了一個嶄新的技術(shù)平臺。膠體金粒子具有高電子密度的特性，當與膠體金顆粒結(jié)合的大分子在相應(yīng)的配體處大量聚集時，會形成肉眼可見的紅色或者粉紅色斑點。膠體金試紙條將各種反應(yīng)試劑以條帶固定在試紙條上，樣本溶液從試紙條的一端通過毛細管作用向另一端移動，樣品中的待測物同層析材料上針對待測物的受體發(fā)生特異性反應(yīng)。結(jié)合膠體金的待測樣本被截留、聚集在層析材料的一定區(qū)域，通過目測可直觀得到顯色[22-25]。本研究利用膠體金試紙條的原理，通過共價修飾有豬特異性核酸序列的膠體金顆粒與硝酸纖維素（nitrocellulose filter，NC）膜上固定的生物素修飾的互補核酸序列相互作用，開發(fā)快速檢測豬肉成分的試紙條及檢測方法，為肉類種源成分快速鑒定技術(shù)的研發(fā)，進行有益的探索。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

紫外可見分光光度計（UV-2600）：日本島津公司；透射電鏡（H7000）：日本日立公司；電磁攪拌加熱器（C-MAG HS7）：德國IKA 公司；微量移液器（F-10）：德國BRAND 公司。

1.2 試驗材料

氯金酸，檸檬酸三鈉，氯化鈉，乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA），十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS），三羥甲基氨基甲烷（2-Amino-2-（hydroxymethyl）-1，3-propanediol，Tris），鹽酸等（以上均為分析純）；蛋白酶K（Proteinase K）：購于sigma 公司。

1.3 豬特異性核酸探針的選擇

根據(jù)Genebank 公布的豬線粒體基因的保守序列（GenBank：AF039170.1），選擇了“CAA CTA GAT ACA TCT ACA TGA TTC ATT AC”這一能代表豬種屬的特異性序列片段，片段長度為29 bp，約10 nm。該片段修飾巰基得到可以與膠體金粒子共價結(jié)合的探針A，以及將該序列的互補片段修飾生物素，得到可以固定在NC 膜上的探針B，探針序列見表1。

表1 探針序列Table 1 Sequences of probes

1.4 膠體金溶液的制備

取濃度0.01%氯金酸溶液100 mL，攪拌（100 r/min）加熱至沸騰并持續(xù)2 min，逐滴加入1%檸檬酸三鈉溶液2 mL，繼續(xù)攪拌加熱6 min，直至溶液呈透亮的酒紅色。冷卻至25 ℃，裝入分子量12 000 MW 的透析袋透析2 d，得到濃度約為3 nmol/L 膠體金溶液。在透射電鏡下觀察溶液中膠體金粒子的大小是否均勻一致，有無橢圓形及多角形金粒子存在，并測量金粒子直徑。

1.5 核酸探針與膠體金的偶聯(lián)

取1 mL 制備好的膠體金溶液，分別加入不同體積的0.1 mmol/L 的豬特異性核酸探針A，37 ℃水浴中溫育12 h，得到膠體金-探針A 復(fù)合物[26]。再分別加入100 μL 濃度為10%的NaCl 溶液，觀察各管的顏色變化，篩選最佳DNA 用量，探針A 的添加量見表2。

表2 核酸探針A 與膠體金偶聯(lián)試驗方案Table 2 Scheme of coupling of probe A and colloidal gold particles

1.6 樣品DNA 提取

稱取剪碎的熟肉樣品100 mg，置于1.5 mL EP 管中，加入1 mL 組織裂解液[10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）]，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，0.5 % SDS，0.4 mg/mL proteinase K），將EP 管置于沸水中煮15 min，然后5 000 r/min 離心10 min，吸取上清。將提取的DNA 樣品進行紫外檢測，確認A260/A280的數(shù)值在1.8~1.9 左右，并用超純水調(diào)節(jié)DNA 濃度，使其A260=1，此時DNA 濃度約0.1 mmol/L。

1.7 試紙的組裝與測試

將不同濃度的探針B 噴在硝酸纖維素膜中間位置，噴涂量為30 μL。37 ℃干燥2 h 后貼在黏性塑料背板上，并在上下兩端分別貼上玻璃纖維膜和吸收濾紙，裁切成3 mm 寬度，即為檢測試紙。取30 μL 金標探針A 溶液分別與系列濃度探針B 的試紙按照表3的方案進行反應(yīng)，通過顯色強度篩選探針B 的最佳濃度，探針B 的濃度如表3 所示。

表3 探針B 最低濃度試驗方案Table 3 Concentration gradient scheme of probe B

1.8 檢測方法的實施

試紙的檢測過程見圖1。

圖1 豬源性成分快速比色檢測原理Fig.1 The schematic of development of a colloidal gold lateral flow strip assay for pork identification

吸取提取的DNA 樣品30 μL，加至100 μL 金標探針A 體系中混勻，37 ℃溫育5 min。將試紙條的玻璃纖維膜一端插入反應(yīng)體系，探針溶液在毛細作用下，開始向試紙條上端流動，等待3 min，判斷顯色情況。如樣品中不含豬肉DNA，則修飾有膠體金米粒子的探針A 會與硝酸纖維素膜上的互補序列進行特異性結(jié)合，大量金粒子堆積在探針B 處，出現(xiàn)紅色可見條帶；反之樣品中含有豬肉DNA 時，則該DNA 會優(yōu)先與膠體金粒子表面的探針A 特異性結(jié)合，形成雙鏈DNA 結(jié)構(gòu)，膠體金粒子探針就不會再與試紙條上的互補DNA發(fā)生結(jié)合，此時硝酸纖維素膜上就不會出現(xiàn)可見條帶，說明檢測的樣品中含有豬肉DNA。

1.9 檢出限

取適量純牛肉，分別添加0%、2%、5%、10%、20%的豬肉，混合攪碎，按照1.7 的方法進行檢測，觀察試紙條檢測結(jié)果，確定最低檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金溶液的表征

采用檸檬酸三鈉還原法制備了膠體金溶液，溶液呈酒紅色。溶液的透射電鏡結(jié)果見圖2。

圖2 膠體金粒子的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of colloidal gold particles

如圖2 所示，在透射電鏡下觀察到金粒子的大小基本一致，分散性比較好，無多角形的金粒子，也沒有聚集現(xiàn)象。通過隨機挑選電鏡照片上10 個金顆粒，測量其平均直徑大小在30 nm 左右。通常膠體金試紙的金粒子直徑在10 nm～40 nm，試紙檢測的信號是由于金粒子聚集而產(chǎn)生的，金粒子太小就不能產(chǎn)生足夠的顏色信號差異。在本研究中金粒子表面要修飾巰基，因此在制備過程中控制膠體金粒子直徑約為30 nm 左右。

2.2 特異性核酸探針選擇

為了得到特異性檢測結(jié)果，從GenBank 公布的豬線粒體基因保守序列（GenBank：AF039170.1）中選擇核酸片段作為檢測目標探針。探針A 通過巰基與膠體金粒子表面形成的金-硫鍵結(jié)合在一起，金-硫鍵的結(jié)合比較牢固，能保證膠體金-探針復(fù)合物在試紙條上運動的過程中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。探針B 生物素偶聯(lián)使得整體分子量變大，從而利用疏水鍵作用固定在NC 膜上。在檢測過程探針B 通過特異性結(jié)合對探針A 進行截留，最終金粒子-探針A 復(fù)合物在探針B 處聚集顯色。核酸探針的長度對檢測方法的特異性和靈敏度有較大影響，探針過短既不利于對金粒子的保護，也不利于互補反應(yīng)的發(fā)生。而過長的序列則會增加反應(yīng)的空間位阻從而降低檢測靈敏度。本研究最終選擇的片段長度為29 bp，約10 nm。

2.3 核酸與膠體金偶聯(lián)的最佳量

膠體金粒子在試紙上的聚集依靠DNA 的互補結(jié)合，偶聯(lián)的核酸越多反應(yīng)越容易發(fā)生，但過多的核酸又會增加反應(yīng)的空間位阻導(dǎo)。本研究通過核酸在鹽溶液中對膠體金的保護試驗確定核酸的最適合用量。核酸探針A 與膠體金偶聯(lián)的目測結(jié)果見表4。

從表4 可以看出，1 管~4 管由于偶聯(lián)核酸的量不足，不能穩(wěn)定膠體金，均呈現(xiàn)出由紅變藍的聚沉現(xiàn)象。從第5 管開始，膠體金的顏色基本一致，說明偶聯(lián)的核酸量達到或超過了穩(wěn)定膠體金的最低量。因此最適DNA 用量為在第5 管（50 μL）基礎(chǔ)上再增加20%，即為實際核酸用量為60 μL。

表4 目測法確定最適用量Table 4 Optimum amount of probe A labeled with colloidal gold by visual inspection

2.4 探針B 噴涂的最適濃度

檢測試紙采用的是競爭法檢測原理，即待測樣品與探針B 競爭結(jié)合探針A，通過顯色差異判定結(jié)果。既要求探針A 和探針B 結(jié)合顯色清晰，且探針的量又不能太高，探針量的增加意味著需要更多的樣品量，方法的檢出限也隨之升高。探針B 最低噴涂濃度篩選的結(jié)果見表5。

表5 探針B 噴涂量的篩選Table 5 Screening of the concentration of probe B

從表5 可知，當序列B 核酸濃度達到7.5 nmol/L時開始有明顯顯色，選定這一濃度作為探針B 的最適噴涂濃度。

2.5 檢出限

提取得到的DNA 樣品需要首先進行濃度鑒定，并調(diào)節(jié)DNA 濃度至0.1 mmol/L 左右，使得在檢測過程中樣本DNA 含量相對于探針A 是過量的，確保探針A全部被反應(yīng)掉，檢測方法有最佳的敏感度。分別測定了含有0%、2%、5%、10%、20%豬肉成分的樣品，檢測結(jié)果見表6。

表6 豬肉檢測試紙條檢測結(jié)果Table 6 Visual result of test strip for pork identification

當樣品中不含有豬肉成分時，檢測線處的紅色條帶清晰可見。隨著樣品中豬肉含量的提高，檢測線處的條帶顏色隨之變淺。當豬肉含量達到5%時，測試線顯色與背景之間的反差已不明顯，且各平行樣品之間略有差異。當豬肉含量達到10%以上時，檢測線處已無明顯的肉眼可辨別的顯色。一般來講，肉類摻假以牟利為目的，摻假量通常都比較高，過低的檢出限在應(yīng)用實踐中意義不大。本研究采用肉眼觀察檢測結(jié)果，不同測試者對臨界結(jié)果的判斷會有較大差異，因此選擇豬肉含量10%作為方法的檢出限。

3 結(jié)論

本文利用共價修飾有豬特異性核酸序列的膠體金顆粒與硝酸纖維素（NC）膜上固定的生物素修飾的互補核酸序列相互作用，開發(fā)了一種用于鑒別豬肉成分的膠體金試紙條及快速檢測方法，研究結(jié)果表明探針A 與膠體金偶聯(lián)的最佳用量為60 μL（0.1 mmol/L），探針B 噴涂的最佳濃度是7.5 nmol/L，試紙條的檢出限為10%。該方法簡單有效，有著較好的應(yīng)用前景。