周文忠，張峻松，鄒 悅，劉 靜，高占勇，楊盼盼*

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.云南同創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)股份有限公司，云南 昆明 650106；3.紅云紅河煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司，云南 昆明 650231)

煙草中多酚類物質(zhì)主要包含：綠原酸、蕓香苷和莨菪亭，其中綠原酸占總多酚含量的75%～90%[1]。多酚在煙草的生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)制特性、煙葉色澤、煙氣香吃味和煙氣生理強(qiáng)度等方面起著重要作用，是衡量煙草品質(zhì)的一個(gè)重要因素[2]。因此，煙草中多酚類物質(zhì)含量的檢測(cè)顯得尤為重要。目前，有文獻(xiàn)[3]報(bào)道的煙草中綠原酸、蕓香苷和莨菪亭含量的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、紫外可見(jiàn)分光光度法等，這些方法存在檢測(cè)成本高、前處理復(fù)雜、難以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)等問(wèn)題。

近紅外光譜法[4-5]作為一種快速、綠色、環(huán)保的光譜分析方法，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、煙草、食品、制藥和石化等各個(gè)行業(yè)。近紅外分析技術(shù)也被應(yīng)用于煙草中的多酚含量的快速測(cè)定，吳玉萍等[5]挑選244個(gè)樣品建立了煙草中總多酚含量的近紅外校正模型，外部驗(yàn)證集20個(gè)樣品的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.10，且近紅外預(yù)測(cè)值與化學(xué)法測(cè)定值之間不存在顯著性差異。章平泉等[6]基于36份煙葉樣品的近紅外光譜，對(duì)比評(píng)價(jià)了不同光譜預(yù)處理方式和不同建模波段的建模效果。結(jié)果表明，綠原酸、新綠原酸和蕓香苷近紅外數(shù)學(xué)模型外部驗(yàn)證的平均相對(duì)誤差和變異系數(shù)(RSD)均在5%以內(nèi)。冷紅瓊等[7]采集200個(gè)樣品的近紅外光譜，使用偏最小二乘法(PLS)，選擇7500～4000 cm-1譜段，采用二階導(dǎo)數(shù)和Norris濾波法(段長(zhǎng)5，段間距3)進(jìn)行光譜預(yù)處理，建立了煙草中綠原酸、蕓香苷、莨菪亭及總多酚的近紅外預(yù)測(cè)模型。結(jié)果表明：近紅外光譜技術(shù)與常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法測(cè)定值在顯著水平0.05時(shí)，不存在顯著性差異。侯英等[8]采用隨機(jī)蛙跳算法對(duì)建模波長(zhǎng)進(jìn)行了篩選。因此，近紅外光譜技術(shù)用于定量分析煙草中綠原酸、蕓香苷、莨菪亭及總多酚具有較強(qiáng)的可行性。

進(jìn)行近紅外定量分析時(shí)，波長(zhǎng)選擇是十分必要的[9]。在增加建模樣本量的基礎(chǔ)上，本研究擬采用不同波長(zhǎng)篩選算法：7500～4000 cm-1波長(zhǎng)范圍[7]、隨機(jī)蛙跳算法[8](Random Frog)和間隔隨機(jī)蛙跳算法[10](Interval Random Frog)，基于模型內(nèi)部評(píng)價(jià)參數(shù)和外部驗(yàn)證結(jié)果，優(yōu)選出最佳的波長(zhǎng)篩選算法，并用于建立煙草中綠原酸、蕓香苷、莨菪亭近紅外校正模型，以期進(jìn)一步提高近紅外校正模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器及材料

近紅外光譜儀：Nicolet Antaris Ⅱ型(美國(guó)Thermo Fisher 公司)；光譜采集及數(shù)據(jù)分析軟件：RSULTTM集成軟件和TQ Analyst 8.6(美國(guó)Thermo Fisher 公司)；光譜數(shù)據(jù)處理及建模軟件；MATLAB R2010a軟件；樣品旋風(fēng)磨(美國(guó)FOSS公司)。600個(gè)陳化煙樣品由云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供，隨機(jī)挑選500個(gè)作為校正集樣品，余下100個(gè)作為外部驗(yàn)證集樣。

1.2 方法

1.2.1 多酚含量的測(cè)定 參照標(biāo)準(zhǔn)方法[11]測(cè)定600個(gè)樣品中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷含量，作為建立近紅外校正模型的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1.2.2 樣品前處理及近紅外光譜的采集 參照標(biāo)準(zhǔn)方法[12]對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。設(shè)置儀器參數(shù)，采集樣品近紅外光譜。

1.2.3 異常樣品的挑選及光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理 采用TQ Analyst 8.6軟件對(duì)樣品近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理方法：多元散射校正(MSC)+二階求導(dǎo)+Norris(5,3)平滑[13]；基于蒙特卡羅采樣的奇異樣本回歸診斷[14]，采用MATLAB R2010a軟件對(duì)校正集樣本中奇異樣本進(jìn)行挑選。

1.2.4 特征波長(zhǎng)變量的篩選及變量數(shù)的確定 采用間隔隨機(jī)蛙跳算法、隨機(jī)蛙跳算法篩選建立煙草中多酚成分(綠原酸、莨菪亭和蕓香苷)近紅外校正模型的特征波長(zhǎng)。間隔隨機(jī)蛙跳算法和隨機(jī)蛙跳(Random Frog)算法[15]參數(shù)為迭代次數(shù)N=10000；開(kāi)始運(yùn)算的變量數(shù)Q=40。利用最小的交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)確定較優(yōu)的波長(zhǎng)變量數(shù)[16]。

1.2.5 校正模型的建立及評(píng)價(jià) 基于間隔隨機(jī)蛙跳算法、隨機(jī)蛙跳算法篩選的特征波長(zhǎng)和7500～4000 cm-1范圍波長(zhǎng)，分別采用偏最小二乘法(Partial Least Squares， PLS)建立煙草中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的近紅外校正模型。由交互驗(yàn)證的均方差(Root Mean Square Error of Cross Validation， RMSECV)最小值決定偏最小二乘法(PLS)適宜主因子數(shù)。

校正模型的評(píng)價(jià)參數(shù)[17]：模型的決定系數(shù)(R2)；校正均方根誤差(Root Mean Square Error of Calibration， RMSEC)；交叉驗(yàn)證均方差(Root Mean Square Error of Cross Validation， RMSECV)；外部驗(yàn)證采用預(yù)測(cè)平均相對(duì)誤差參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以上過(guò)程均采用MATLAB R2010a軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜預(yù)處理及異常樣品的挑選

在建立校正模型之前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行奇異值檢測(cè)，剔除異常樣品可以提高模型的穩(wěn)健性[18]。模群迭代奇異樣本診斷[14]是一種基于奇異樣本點(diǎn)對(duì)預(yù)測(cè)殘差和預(yù)測(cè)誤差很敏感的原理，采用預(yù)測(cè)誤差的分布為依據(jù)的診斷方法。光譜預(yù)測(cè)誤差的均值-方差分布如圖1所示(以綠原酸為例)。由圖1可知，異常樣本(outlier)個(gè)數(shù)為5個(gè)(樣品編號(hào)：9、123、124、215和270)，剔除異常樣品后剩下的樣本集樣品595個(gè)(校正集樣品：495個(gè)，驗(yàn)證集樣品：100個(gè))。采用上述方法對(duì)莨菪亭和蕓香苷的異常樣品進(jìn)行剔除，莨菪亭和蕓香苷樣品均剔除異常樣品4個(gè)，剔除異常樣品后剩下的樣本集樣品596個(gè)(校正集樣品：496個(gè)，驗(yàn)證集樣品：100個(gè))。建模集樣品中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷含量范圍分別為6.70%～28.71%、0.08%～0.71%和4.42%～17.07%。

剔除異常樣品后，樣品原始近紅外漫反射光譜經(jīng)多元散射校正(MSC)+二階求導(dǎo)+Norris(5,3)平滑預(yù)處理后的光譜如圖2所示。由圖2b可知，經(jīng)預(yù)處理后的近紅外光譜在10000～9000 cm-1存在高頻噪聲，在進(jìn)行近紅外校正模型建立時(shí)應(yīng)將此波段排除在外，因此選擇9000～4000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行特征波長(zhǎng)或波段的篩選。

圖1 綠原酸近紅外校正模型模群迭代奇異樣本診斷圖

圖2 代表性樣品近紅外漫反射光譜(a)和經(jīng)預(yù)處理后(b)的光譜圖

2.2 特征波長(zhǎng)變量的篩選

隨機(jī)蛙跳算法能夠利用少量的變量迭代進(jìn)行建模，是一種非常有效的高維數(shù)據(jù)變量選擇方法。間隔隨機(jī)蛙跳算法是一種基于隨機(jī)蛙跳算法，性能更加優(yōu)越的波長(zhǎng)變量篩選算法。兩種方法通過(guò)輸出每個(gè)變量選擇可能性，根據(jù)變量重要性進(jìn)行波長(zhǎng)選擇。采用隨機(jī)蛙跳和間隔隨機(jī)蛙跳算法分別對(duì)煙草中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷近紅外校正模型的特征波長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行提取，不同的波長(zhǎng)點(diǎn)有不同的選擇概率。以莨菪亭為例，不同波長(zhǎng)點(diǎn)被選取的概率如圖3所示。

由圖3可知，間隔隨機(jī)蛙跳波長(zhǎng)篩選算法較隨機(jī)蛙跳算法篩選出被選擇概率大的波長(zhǎng)點(diǎn)分布更為集中。通過(guò)模型交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)隨變量數(shù)增加的變化情況，在RMSECV取得最小值時(shí)確定為較優(yōu)的變量數(shù)。以綠原酸為例，RMSECV隨波長(zhǎng)變量數(shù)增加變化的趨勢(shì)如圖4所示。隨機(jī)蛙跳算法和間隔隨機(jī)蛙跳算法選出的莨菪亭近紅外校正模型最優(yōu)變量數(shù)分別為273和147。隨機(jī)蛙跳算法和間隔隨機(jī)蛙跳算法選出的綠原酸和蕓香苷近紅外校正模型較優(yōu)的變量個(gè)數(shù)依次為：262、198和283、175。依據(jù)變量重要性分別選擇最優(yōu)建模波長(zhǎng)數(shù)作為校正模型輸入變量。

圖3 采用蛙跳算法和間隔蛙跳算法計(jì)算出的不同波長(zhǎng)點(diǎn)變量的選擇概率

圖4 交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)隨變量數(shù)的變化

2.3 校正模型的建立及評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)不同波長(zhǎng)(波長(zhǎng)點(diǎn))變量條件下建立的煙草多酚校正模型的精度。本研究選擇7500～4000 cm-1波長(zhǎng)變量及通過(guò)隨機(jī)蛙跳算法和間隔隨機(jī)蛙跳算法篩選出波長(zhǎng)點(diǎn)變量，分別采用偏最小二乘法(PLS)建立煙草中多酚類化合物綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的近紅外校正模型。

以綠原酸校正模型為示例，隨機(jī)蛙跳和間隔隨機(jī)蛙跳算法篩選波長(zhǎng)變量建立校正模型中交互驗(yàn)證均方差(RMSECV)隨主成分?jǐn)?shù)的變化見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著主成分?jǐn)?shù)的增加，兩種算法篩選波長(zhǎng)變量建立近紅外校正模型的RMSECV逐漸降低，取得RMSECV最小值時(shí)對(duì)應(yīng)的主成分?jǐn)?shù)為最優(yōu)的建模主成分?jǐn)?shù)。隨機(jī)蛙跳算法和間隔隨機(jī)蛙跳算法最優(yōu)的主成分?jǐn)?shù)分別為11和12。

圖5 煙草中綠原酸的近紅外校正模型交互驗(yàn)證均方差(RMSECV)隨主因子的變化

以綠原酸校正模型為例，分別采用7500～4000 cm-1光譜波長(zhǎng)變量+PLS、Random Frog+ PLS和Interval Random Frog+PLS所建立校正模型的效果如圖6～圖8所示。莨菪亭、綠原酸和蕓香苷依照上述步驟方法建立近紅外校正模型的內(nèi)部評(píng)價(jià)參數(shù)(表1)和用100個(gè)外部驗(yàn)證集預(yù)測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(表2)。

由圖6～圖8和表1～表2可知，在光譜預(yù)處理方式、校正集樣本、驗(yàn)證集樣本和建模參數(shù)一致的條件下，以綠原酸為例，對(duì)比3種不同波長(zhǎng)或波長(zhǎng)篩選算法：7500～4000 cm-1、Random Frog和Interval Random Frog，決定系數(shù)由0.9462增加至0.9721；校正集的均方估計(jì)殘差由1.1458降低到0.7741；交互驗(yàn)證均方差由1.1254降低到0.8210。100個(gè)外部驗(yàn)證集預(yù)測(cè)平均相對(duì)誤差由8.337%降低到7.025%。3種波長(zhǎng)或波長(zhǎng)篩選算法建立的煙草莨菪亭和蕓香苷近紅外校正模型建模效果對(duì)比與綠原酸相似。以上結(jié)果表明，采用Interval Random Frog+PLS建立的近紅外校正模型的內(nèi)部評(píng)價(jià)參數(shù)(決定系數(shù)、均方估計(jì)殘差RMSEC和交互驗(yàn)證均方差RMSECV)優(yōu)于Random Frog+ PLS方法，后者又優(yōu)于7500～4000 cm-1光譜波長(zhǎng)變量+PLS。100個(gè)外部驗(yàn)證集樣品驗(yàn)證結(jié)果表明Interval Random Frog+PLS優(yōu)于Random Frog+ PLS方法，后者又優(yōu)于7500～4000 cm-1光譜波長(zhǎng)變量+PLS。

圖6 煙草中綠原酸近紅外校正模型效果圖(7500～4000 cm-1+PLS)

3 結(jié)論

基于相同光譜預(yù)處理和建模方法，相同的校正集和驗(yàn)證集樣品光譜分別通過(guò)7500～4000 cm-1、隨機(jī)蛙跳算法篩選和間隔隨機(jī)蛙跳算法篩選波長(zhǎng)點(diǎn)變量建立煙草中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的近紅外校正模型，并對(duì)建模效果進(jìn)行內(nèi)外部評(píng)價(jià)。結(jié)果表明采用間隔蛙跳篩選輸入變量時(shí)，模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性最優(yōu)。通過(guò)波長(zhǎng)優(yōu)選進(jìn)一步提升了煙草綠原酸、莨菪亭和蕓香苷近紅外校正模型的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，為該方法的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖7 煙草中綠原酸近紅外校正模型效果圖(Random Frog+PLS)

圖8 煙草中綠原酸的近紅外校正模型效果圖(Interval Random Frog+ PLS)

表1 不同建模輸入變量條件下建立的煙草中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷近紅外預(yù)測(cè)模型評(píng)價(jià)指標(biāo)的比較

表2 不同建模輸入變量條件下建立的煙草中綠原酸、莨菪亭和蕓香苷近紅外預(yù)測(cè)模型外部驗(yàn)證評(píng)價(jià)指標(biāo)的比較