腫瘤壞死因子超家族成員14調(diào)控炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制*

袁小媚，顧清，劉莉，王文艷

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院心內(nèi)科，成都 610047)

高脂血癥以血液中脂質(zhì)或脂蛋白水平異常升高為特征。高脂血癥是引起動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和急性胰腺炎最常見的原因[1]。高脂血癥分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。原發(fā)性高脂血癥通常是由于遺傳基因或高脂飲食引起；繼發(fā)性高脂血癥通常由于其他代謝疾病引起，例如高血壓和糖尿病。近年來，高脂血癥和炎癥之間的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注。慢性感染性疾病，如紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎已表現(xiàn)出高脂血癥高發(fā)[2]。研究表明，免疫細(xì)胞參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)[3]，而高脂血癥伴有免疫激活和炎癥反應(yīng)，因此動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是脂質(zhì)代謝介導(dǎo)的慢性炎性疾病。在高脂血癥的情況下，低密度脂蛋白( low density lipoprotein，LDL)被氧化為氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)，并且在動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)累積進(jìn)而觸發(fā)炎癥。但炎癥對(duì)脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制目前少有研究。

腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor superfamily，TNFSF)成員在免疫學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，例如T細(xì)胞活化、共刺激和免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡[4-6]。TNFSF成員14(LIGHT)是由Dr.Mauri 首次發(fā)現(xiàn)的II型膜蛋白。LIGHT以同型三聚體形式存在，可以通過HVEM(TNFSFR14)、淋巴毒素β受體(LTβR)和誘餌受體3(DcR3)調(diào)控免疫反應(yīng)過程。LIGHT/HVEM相互作用有助于T細(xì)胞活化，LIGHT/ LTβR相互作用可能與調(diào)節(jié)基質(zhì)/抗原呈遞細(xì)胞(APC)/T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)[7]。動(dòng)物模型和一些臨床研究顯示LIGHT可能對(duì)各種炎癥疾病的發(fā)生有重要作用[8-9]，LIGHT也涉及血管炎癥的發(fā)病[10]。此外，LIGHT可能通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)途徑與肥胖和2型糖尿病關(guān)聯(lián)[11-13]。但是，LIGHT參與動(dòng)脈粥樣硬化的研究很少。

基于LIGHT在血管炎癥和代謝紊亂疾病中的作用，推測LIGHT可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過程，導(dǎo)致高脂血癥的最終形成。這個(gè)假設(shè)通過各種實(shí)驗(yàn)方法來證實(shí)，包括在冠心病患者中開展臨床研究和在oxLDL誘導(dǎo)的人源單核巨噬細(xì)胞(THP-1)的實(shí)驗(yàn)研究。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 32例冠心病患者根據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)分2組，即不穩(wěn)定型心絞痛組和穩(wěn)定型心絞痛組，各16例。16例健康人作為正常對(duì)照組，收集研究對(duì)象的血液樣本進(jìn)行研究。所有的患者都由四川省人民醫(yī)院心內(nèi)科募集，并簽署知情同意書，研究通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) ELISA 方法根據(jù)說明書操作(Sigma，St.Louis，USA)。血漿樣品預(yù)先滴定在ELISA板上作為抗原。O-聯(lián)茴香胺(Sigma-D3252，St.Louis，USA)作為底物，吸附的染色辣根過氧化物酶(HRP)產(chǎn)物通過分光光度計(jì)(TU2450，Shimadzu，Japan)在405 nm處使用自動(dòng)讀板機(jī)測定(Thermo，Waltham，USA)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)和處理 細(xì)胞分為5組：①陰性對(duì)照組；②LIGHT組；③oxLDL組；④LIGHT+oxLDL 組；⑤LIGHT+oxLDL+LTβR免疫球蛋白凝集素(LTβR-Ig) 組，即THP-1細(xì)胞在常規(guī)無血清RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY)中在37 ℃、 5%二氧化碳(CO2)條件下培養(yǎng)。由佛波酯(PMA ，100 ng·mL-1，Sigma，St.Louis，USA) 刺激細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞(陰性對(duì)照組)，然后單獨(dú)oxLDL(20 mg·L-1；Sigma，St.Louis，USA)或者聯(lián)合LIGHT(200 ng·mL-1；R&D Systems，Minneapolis，Minneapolis，USA)、LTβR免疫球蛋白凝集素(LTβR-Ig)一起孵育24 h。

1.5Western blotting檢測 細(xì)胞全蛋白樣本的提取按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行。等量的蛋白質(zhì)樣本通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)膠分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(poly vinylidene fluoride，PVDF)膜上。PVDF膜在含5%脫脂牛奶的T-BST中室溫孵育。在4 ℃條件下孵育一抗(Santa Cruz Biotechnology，CA，USA)，然后室溫孵育HRP標(biāo)記的二抗，多次洗膜。最后，使用ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)和Quantity One分析軟件分別檢測和分析蛋白(Bio-Rad，USA)。GAPDH作為內(nèi)源性參照蛋白。

1.6油紅O染色 oxLDL和(或)LIGHT處理的巨噬細(xì)胞使用4%甲醛溶液固定30 min，然后油紅O染色15 min。最后，細(xì)胞的形態(tài)通過配置放大200倍數(shù)成像系統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡觀察(Olympus，Tokyo，Japan)。泡沫細(xì)胞即被油紅O染色的細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.2LIGHT促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)的產(chǎn)生和累積 見圖2，oxLDL刺激細(xì)胞后，清道夫受體(SR-A)表達(dá)和乙酰輔酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-1(Acyl-CoA cholesterol acyltransferase -1，ACAT1)顯著升高(P<0.05)，LIGHT作用進(jìn)一步加強(qiáng)了其表達(dá)(P<0.01)。但是，當(dāng)加入LTβR免疫球蛋白凝集素(LTβR-Ig，)后，LIGHT的增強(qiáng)效果被消除(P<0.01)。LIGHT進(jìn)一步增強(qiáng)oxLDL誘導(dǎo)脂解基因(PPARα，CPT-1)表達(dá)降低，脂肪基因(SREBP-1c，ACS)表達(dá)升高以及脂質(zhì)累積(P<0.05)。LIGHT的這些效果被LTβR-Ig阻止。這些結(jié)果表明，LIGHT可以促進(jìn)THP-1細(xì)胞脂質(zhì)的產(chǎn)生和累積。

2.3LIGHT上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng) 見圖3，LIGHT進(jìn)一步促進(jìn)oxLDL引起的促炎細(xì)胞因子(IL-6、 MCP-1、iNOS)的表達(dá)，并抑制抗炎細(xì)胞因子(IL-4、 IL-10)的表達(dá)。但是，LIGHT的作用被LTβR-Ig阻止(P<0.05)。這些結(jié)果表明THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)活化LIGHT信號(hào)可加速oxLDL引起的炎癥發(fā)生。

2.4LIGHT通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥和脂質(zhì)代謝 為了探索LIGHT調(diào)控作用的可能機(jī)制，將特異性細(xì)胞滲透性NF-κB核轉(zhuǎn)移肽抑制劑SN50用于本實(shí)驗(yàn)。如圖4所示，SN50顯著抑制NF-κB、p65、IL-6和脂肪基因的表達(dá)，并且促進(jìn)IL-4 和 PPARα在oxLDL或LIGHT刺激的細(xì)胞中的表達(dá)(P<0.05)。此外，SN50顯著抑制LIGHT和oxLDL在炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)生成上的協(xié)同作用(P<0.05)。這些結(jié)果表明LIGHT通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥和脂質(zhì)代謝。

3 討論

LIGHT參與固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并與各種炎癥和自身免疫疾病關(guān)聯(lián)[8-9]。LIGHT在許多代謝疾病，例如2型糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和非酒精性脂肪性肝中高表達(dá)[13-14]。另外，巨噬細(xì)胞中LIGHT已經(jīng)被證明可增加脂質(zhì)的攝取[15]，抑制脂肪分化[16]，通過抑制肝脂蛋白脂肪酶引起高三酰甘油血癥。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校琇IGHT已經(jīng)和肥胖建立關(guān)聯(lián)[11]，促進(jìn)代謝引起的炎癥[12]。本研究發(fā)現(xiàn)LIGHT在冠心病患者中高表達(dá)[13]。這個(gè)結(jié)果從另一個(gè)角度驗(yàn)證了LIGHT和高脂血癥的相關(guān)性。

THP-1細(xì)胞在脂質(zhì)代謝相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用，因?yàn)門HP-1分化巨噬細(xì)胞在誘導(dǎo)清道夫受體、積聚膽固醇酯和分泌脂蛋白脂肪酶等方面可以模擬人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞[17]。清道夫受體是整合膜蛋白，可以介導(dǎo)脂蛋白的內(nèi)吞作用。ACAT-1在細(xì)胞內(nèi)膽固醇動(dòng)態(tài)平衡和動(dòng)脈粥樣硬化疾病中是一個(gè)關(guān)鍵的酶[18]。本研究結(jié)果顯示，在oxLDL刺激的巨噬細(xì)胞中，LIGHT顯著升高有助于脂肪生成的SR-A、 ACAT-1、 SREBP-1c 和ACS因子的表達(dá)。此外，LIGHT顯著降低脂解基因PPARa 和 CPT-1的水平。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)在細(xì)胞和分子水平，LIGHT可以促進(jìn)脂肪生成。

圖1 3組LIGHT表達(dá)及炎癥反應(yīng)水平(n=3)

Fig.1LIGHTexpressionandinflammatoryresponseinthreegroups(n=3)

A.陰性對(duì)照組；b.LIGHT組；c.oxLDL組；d.LIGHT+oxLDL 組；e.LIGHT+oxLDL+LTβR-Ig組。 A.SR-A 和 ACAT1表達(dá)；B.SR-A定量；C.ACAT1定量；D.PPARa、 CPT-1、 SREBP-1c 和 ACS表達(dá)； E.PPARα定量；F.CPT-1定量；G.SREBP-1c 定量；H.ACS定量；I.細(xì)胞內(nèi)膽固醇在油紅O染色下的陽性表現(xiàn)(×200倍)；J.油紅O染色的綜合吸光度值。 ①與陰性對(duì)照組比較，P<0.05；②與oxLDL比較，P<0.05；③與oxLDL+LIGHT組比較，P<0.05。

A.negative control group;b.LIGHT group;c.ox -LDL group;d.LIGHT+oxLDL group；e.LIGHT+ oxLDL +LT beta R -Ig group.A. Expression of SR-A and ACAT1 ；B.SR-A level；C.ACAT1 level;D.Expression of PPARa, CPT-1, SREBP-1c and ACS；E.PPARa level；F.CPT -1 level；G.SREBP-1c level；H.ACS level；I.positive expression of intracellular cholesterol by using red oil O staining(×200)；J.Comprehensive optical density of red oil O staining.①Compared with negative control group,P<0.05；②Compared with oxLDL group,P<0.05；③Compared with oxLDL +LIGHT group,P<0.05.

A.陰性對(duì)照組；b.LIGHT組；c.oxLDL組；d.LIGHT+oxLDL 組；e.LIGHT+oxLDL+LTβR-Ig組。 A.IL-6、 MCP-1、 iNOS、 IL-4 和IL-10表達(dá)；B.IL-6定量；C.MCP-1定量；D.iNOS定量； E.IL-4定量；F.IL-10定量。 ①與陰性對(duì)照組比較，P<0.05；②與oxLDL比較，P<0.05；③與oxLDL+LIGHT組比較，P<0.05。

A.negative control group;b.LIGHT group;c.ox-LDL group;d.LIGHT+oxLDL group；e.LIGHT+ oxLDL +LT beta R -Ig group.A.Expression of IL-6, MCP-1, iNOS, IL-4 and IL-10；B.IL-6 level；C.MCP-1 level;D.iNOS level;E.IL-4 level；F.IL-10 level.①Compared with negative control group,P<0.05；②Compared with oxLDL group,P<0.05；③Compared with oxLDL +LIGHT group,P<0.05.

免疫系統(tǒng)和炎癥過程在動(dòng)脈粥樣硬化疾病形成和進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中，單核細(xì)胞聚集到炎癥部位，分化為巨噬細(xì)胞并引發(fā)免疫反應(yīng)[19]。巨噬細(xì)胞可以分化為M1或M2表型，促動(dòng)脈粥樣硬化的M1巨噬細(xì)胞以表面標(biāo)志CD68和高表達(dá)的促炎細(xì)胞因子，如IL-6和iNOS為特征；抗動(dòng)脈粥樣硬化的M2巨噬細(xì)胞主要參與炎癥分解和誘導(dǎo)IL-4和IL-10[20-22]。研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者伴有嚴(yán)重的炎癥，因?yàn)楣谛牟』颊吒弑磉_(dá)CD68和低表達(dá)CD163。此外，oxLDL刺激THP-1巨噬細(xì)胞在LIGHT作用下分化為M1表型。這些結(jié)果表明LIGHT誘導(dǎo)炎癥可能有助于高脂血癥進(jìn)展。

LIGHT有3種受體，即HVEM、LTβR和DcR3。在免疫系統(tǒng)中，LIGHT活化T細(xì)胞應(yīng)答通過HVEM通路[12-13]。LTβR對(duì)淋巴器官和細(xì)胞定位有重要影響。LTβR-Ig與LIGHT同型三聚體結(jié)合因而阻止LTβR和HVEM兩條信號(hào)通路，并阻止LIGHT結(jié)合到DcR3。本研究中，LTβR-Ig用來阻斷LIGHT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果顯示LTβR-Ig完全抑制LIGHT誘導(dǎo)的炎癥和脂肪生成。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證明了LIGHT是一個(gè)致動(dòng)脈粥樣硬化因子。

A.陰性對(duì)照組；b.LIGHT組；c.oxLDL組；d.LIGHT+SN50 組；e.LIGHT+oxLDL組；f.LIGHT+oxLDL+SN50 組。 A.NF-κB p65、SR-A、PPARα、SREBP-1c、 IL-6 和 IL-4表達(dá)；B.NF-κB p65定量；C.SR-A定量；D.PPARα定量； E.SREBP-1c定量；F.IL-6定量；G.IL-4定量。①與oxLDL比較，P<0.05；②與oxLDL+LIGHT組比較，P<0.05。

A.oxLDL group;b.LIGHT group;c.Ox -LDL group;d.LIGHT+SN50 group;e.LIGHT+ oxLDL group；f.LIGHT+ oxLDL +SN50 group.A.Expression of NF-kB p65, SR-A, PPARα, SREBP-1c, IL-6 and IL-4；B.NF-kB p65 level；C.SR-A level;D.PPARα level;E.SREBP-1c level；F.IL-6 level；G.IL-4 level.①Compared with oxLDL group,P<0.05；②Compared with oxLDL +LIGHT group,P<0.05.

NF-κB在動(dòng)脈粥樣硬化不同階段均可被激活[23-24]。oxLDL結(jié)合到其受體LOX-1激活NF-κB，增強(qiáng)泡沫細(xì)胞的形成和炎癥細(xì)胞因子的釋放[24-25]。敲除NF-κB導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變降低，并且在病灶處幾乎沒有泡沫細(xì)胞。SN50是一個(gè)協(xié)同蛋白，包含Kaposi成纖維細(xì)胞生長因子的信號(hào)序列和NF-κB的核定位序列。SN50具有特異性阻斷活化的NF-κB核移位的能力。研究發(fā)現(xiàn)，SN50介導(dǎo)抑制NF-κB有效逆轉(zhuǎn)LIGHT誘導(dǎo)的炎癥和脂肪生成，表明LIGHT通過激活NF-κB表現(xiàn)出促動(dòng)脈粥樣硬化作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了動(dòng)脈粥樣硬化患者炎癥和LIGHT高表達(dá)，LIGHT NF-κB依賴性加重炎癥反應(yīng)和促進(jìn)脂質(zhì)產(chǎn)生和聚集，這個(gè)過程可能是造成高脂血癥進(jìn)展的原因。但是，當(dāng)前的研究具有一些局限性，LIGHT和高脂血癥的這種關(guān)系僅僅體現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化疾病，特別是冠心病。LIGHT對(duì)其他高脂血癥相關(guān)疾病的影響需要進(jìn)一步探索。LIGHT可能有助于高脂血癥的進(jìn)展，本研究對(duì)高脂血癥相關(guān)疾病的治療提供了一個(gè)新的潛在靶標(biāo)。