小花棘豆Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因的Southern blot檢測(cè)分析

珠麗，盧萍，席領(lǐng)軍，高峰，李玉玲，姜?jiǎng)P

（內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010022）

小花棘豆（Oxytropis glabra DC.）是豆科棘豆屬多年生草本植物，許多植株內(nèi)含生物堿苦馬豆素（swainsonine，SW），國(guó)際上將含SW的棘豆屬（Oxytropis）、黃芪屬（Astragalus）等有毒植物統(tǒng)稱(chēng)為瘋草，而SW是引起動(dòng)物瘋草病的唯一毒素[1]。SW陽(yáng)離子半椅式構(gòu)象與甘露糖陽(yáng)離子構(gòu)象類(lèi)似，可與甘露糖苷競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制α-甘露糖苷酶Ⅰ和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性[2]，造成細(xì)胞功能紊亂，使牲畜出現(xiàn)中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)致死。通過(guò)對(duì)小花棘豆的研究發(fā)現(xiàn)，凡能夠分離或檢測(cè)到Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌的植株均含SW，且體外培養(yǎng)該內(nèi)生真菌合成了SW，從而提出小花棘豆的SW毒性由該內(nèi)生真菌引起。

瘋草內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因（saccharopine reductase gene，sac）編碼酵母氨酸還原酶[3-4]催化賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)化為酵母氨酸后，生成的α-氨基己二酸半醛是內(nèi)生真菌合成SW的一個(gè)重要前體[5]。前期實(shí)驗(yàn)中克隆到A.oxytropis的sac cDNA（KJ944635）和基因（KY052048），獲得sac缺失突變體M1，發(fā)現(xiàn)酵母氨酸還原酶促進(jìn)真菌SW的合成。

Southern blot由Southern[6]于1975年創(chuàng)建，是分析基因結(jié)構(gòu)和檢測(cè)特定DNA片段的經(jīng)典技術(shù)，可檢測(cè)外源目的基因是否已轉(zhuǎn)入并整合到生物染色DNA上，同時(shí)可對(duì)外源片段拷貝數(shù)進(jìn)行分析。Southern blot中使用的標(biāo)記探針有放射性同位素和非放射性?xún)深?lèi)，其中放射性探針靈敏度較高，但半衰期短，且有放射性輻射；非放射性標(biāo)記又分為生物素標(biāo)記和地高辛標(biāo)記，非同位素標(biāo)記探針可避免放射性危害，且由于生物體內(nèi)沒(méi)有地高辛，可更好地消除內(nèi)源背景，應(yīng)用效果更好[7]。

Southern blot操作程序繁瑣，對(duì)基因組DNA的提取、純化、酶切等均有較高要求，要獲得理想雜交結(jié)果需反復(fù)摸索，雖可使用相關(guān)試劑盒，但需根據(jù)具體情況優(yōu)化雜交方案。本研究利用PCR制備地高辛（DIG）標(biāo)記探針，并對(duì)Southern blot方法進(jìn)行了探索和優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

供試菌種：小花棘豆A.oxytropis內(nèi)生真菌野生株OW7.8和sac缺失突變株M1由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒，購(gòu)自Axygen；真菌基因DNA 提取試劑盒、核酸共沉劑、限制性酶、6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker，購(gòu)自Takara；核酸染料購(gòu)自Bio TAQ；DIG標(biāo)記試劑盒、Hyb高效雜交液，購(gòu)自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技；氨芐青霉素、潮霉素 B，購(gòu)自sigma；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)ZHJH-1109 型，上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)；真菌培養(yǎng)箱MGC-350BP-2型，上海一恒科技有限公司生產(chǎn)；冷凍離心機(jī)3-18K/D-37520 型，德國(guó) SIGMA生產(chǎn)；超微量測(cè)濃儀Q5000型，美國(guó) Quawell生產(chǎn)；PCR 擴(kuò)增儀050-810Tgradient48 型，德國(guó)Biometra-grandien生產(chǎn)；全自動(dòng)高壓滅菌鍋HVE-50 型，日本 HIRAYAMA生產(chǎn)；電泳儀BG-Power 600型，北京百晶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)BG-gds AUTO，北京百晶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；超聲波清洗器PS-20，潔康超聲波設(shè)備有限公司生產(chǎn)；Hybridization oven OV4000，德國(guó)耶拿分析儀器公司生產(chǎn)；隔水培養(yǎng)箱GH6000，天津泰斯特儀器生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 PCR法制備DIG標(biāo)記探針

根據(jù)內(nèi)生真菌sac中間序列設(shè)計(jì)特異性引物DSF/DSR和SEMF/SEMR，以pTOPO-sac1（含內(nèi)生真菌sac）為模板制備野生型探針。PCR反應(yīng)體系為：pTOPO-sac11.0 μg，10×PCR Buffer 2.0 μL，DigdUTP 1.0 μL，rTaq酶1.0 μL，上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），ddH2O補(bǔ)足至20 μL。引物DSF/DSR的PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s； 57 ℃30 s；72 ℃ 1 min，30次循環(huán)；72 ℃ 10 min。引物SEMF/SEMR的PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，（95 ℃30s，62 ℃ 30s，72 ℃ 30s）×30，72 ℃ 10 min。

根據(jù)pCB1003（含hph）質(zhì)粒上的hph序列設(shè)計(jì)特異性引物HGF/YGR，以質(zhì)粒為模板制備突變型探針。PCR反應(yīng)體系除模板其余與上面體系相同。PCR反應(yīng)條件與DSF/DSR的相同。引物序列見(jiàn)表1。

在做標(biāo)記反應(yīng)的同時(shí)，做一個(gè)相同體系非標(biāo)記PCR。反應(yīng)結(jié)束后取標(biāo)記和非標(biāo)記PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)（1%瓊脂糖），剩余探針保存于-20 ℃，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 PCR引物序列

1.2.2 基因組DNA提取、酶切與轉(zhuǎn)膜

（1）真菌基因組DNA提取

將OW7.8和M1接種于PDA培養(yǎng)基上，M1培養(yǎng)基含潮霉素B（終濃度為50 μg/mL），接種后置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。

刮取50 mg菌絲體放入預(yù)冷研缽中，加液氮迅速研磨至粉末，后置離心管中，加500 μL 4×CTAB提取液（含1% β-巰基乙醇）、4 μL RNase（100 mg /mL）充分搖勻，65 ℃水浴保溫40 min，再加等體積酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）混勻，4 ℃12000r/min離心5 min。在上清液中加2.5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，4℃12000r/min離心15 min，棄上清液。70%乙醇離心洗滌兩次，4℃12000r/min離心5 min，棄上清液，80℃烘10 min，加100μL ddH2O，37 ℃水浴1 min，測(cè)定DNA濃度及OD值，取5μL進(jìn)行電泳檢測(cè)。

（2）基因組DNA限制酶切反應(yīng)

選擇限制性?xún)?nèi)切酶Eco RⅤ、Pst Ⅰ、Pci Ⅰ、PvuⅡ進(jìn)行酶切反應(yīng)，總體積50 μL，反應(yīng)體系見(jiàn)表2和表3。基因組DNA終濃度調(diào)至20 ng，于37 ℃酶切12 h，視情況延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至完全酶切，65 ℃保溫10 min，停止反應(yīng)。使用核酸共沉劑進(jìn)行酶切產(chǎn)物的純化和濃縮，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（0.8%）。

表2 OW7.8基因組DNA酶切反應(yīng)體系

（3）轉(zhuǎn)膜和固定

向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移20 h以上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)效果。取膜，切右上角標(biāo)示方向。將尼龍膜浸入6×SSC溶液中5 min，80 ℃烘烤2 h，進(jìn)行膜固定，固定后用于雜交。

表3 突變株株基因組DNA酶切反應(yīng)體系

1.2.3 Southern blot

加Hyb高效雜交液50 ℃預(yù)雜交3 h（15 r/min）以封閉非特異性位點(diǎn)。標(biāo)記好的探針（25 ng/mL）沸水浴10 min后立即冰浴10 min備用。倒掉預(yù)雜交液，加入50 ℃ 5 mL Hyb高效雜交液及變性地高辛標(biāo)記探針（1～3 μL/膜，5～20 ng探針/mL Hyg雜交液）混勻，50 ℃雜交過(guò)夜。

取出尼龍膜50 ℃水浴震蕩洗滌，室溫封阻尼龍膜30 min、結(jié)合抗體30 min、洗抗體兩次（15 min/次），加300μL NBT/BCIP顯色底物于37 ℃培養(yǎng)箱中避光顯色20 h后，短時(shí)間暴露于光下用50 mL ddH2O洗膜5 min，停止顯色，拍照記錄[8-12]。

2 結(jié)果

2.1 PCR法制備地高辛（DIG）標(biāo)記探針

內(nèi)生真菌sac探針電泳結(jié)果如圖1所示，泳道1為非標(biāo)記sac PCR反應(yīng)產(chǎn)物，泳道2為DIG標(biāo)記的sac探針，其電泳條帶約709 bp，與預(yù)期結(jié)果相同。hph探針電泳結(jié)果如圖2所示，泳道1為DIG標(biāo)記的hph探針，泳道2為同樣條件下的非標(biāo)記PCR反應(yīng)產(chǎn)物，電泳條帶約879 bp，與預(yù)期結(jié)果相同。標(biāo)記反應(yīng)PCR產(chǎn)物中帶非同位素的配體（生物素、地高辛等），其電泳遷移率慢于非標(biāo)記PCR產(chǎn)物。

圖1 OW7.8探針DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 M1探針DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 OW7.8及M1基因組DNA限制性酶切與轉(zhuǎn)膜

將提取的OW7.8和M1基因組DNA（終濃度為20.75±7.64 μg）用Eco RⅤ、Pst Ⅰ、Pci Ⅰ和Pvu Ⅱ限制酶進(jìn)行切割，酶切產(chǎn)物濃度為202.6±13.8 ng/μL，OD 260/OD 280在1.88～2.01，電泳結(jié)果如圖3所示。其中泳道1為野生株基因組DNA，泳道2、3為用限制酶Eco RⅤ、Pst Ⅰ酶切OW7.8基因組DNA后產(chǎn)物，由圖可見(jiàn)酶切后泳道呈彌散狀，無(wú)明顯條帶，說(shuō)明酶切效果較好。泳道4、5為使用限制酶為Pci Ⅰ、Pvu Ⅱ酶切M1基因組DNA后的產(chǎn)物，結(jié)果顯示泳道4酶切反應(yīng)不完全，泳道5酶切反應(yīng)完全。分別將OW7.8基因組用限制酶Eco RⅤ再進(jìn)行酶切，將M1基因組用限制酶PciⅠ再進(jìn)行酶切，結(jié)果如圖4，可看到酶切反應(yīng)進(jìn)行徹底。轉(zhuǎn)膜后觀察凝膠結(jié)果如圖5，凝膠上沒(méi)有任何殘留DNA，說(shuō)明酶切產(chǎn)物已全部移至尼龍膜。

圖3 基因組DNA酶切產(chǎn)物

圖4 基因組DNA酶切產(chǎn)物

圖5 轉(zhuǎn)膜后的凝膠

2.3 Southern blot

由內(nèi)生真菌sac特異性探針與M1基因組DNA和OW7.8基因組DNA酶切產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot試驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。泳道1表示sac探針與Pvu Ⅱ切割M1基因組DNA雜交，雜交結(jié)果呈陰性，表明M1中sac已被敲除；泳道2和3分別用Eco RⅤ和Pst Ⅰ切割OW7.8基因組DNA進(jìn)行雜交，雜交結(jié)果呈陽(yáng)性，說(shuō)明野生株有sac，且基因的拷貝數(shù)為1。

由hph特異性探針與M1基因組DNA和OW7.8基因組DNA酶切產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot試驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。泳道1表示hph探針與Pvu Ⅱ切割M1基因組DNA雜交，發(fā)現(xiàn)M1雜交結(jié)果呈陽(yáng)性，說(shuō)明標(biāo)記基因hph成功整合到M1基因組中；泳道2和泳道3分別用hph特異性探針與Eco RⅤ和Pst Ⅰ切割的OW7.8基因組DNA雜交，結(jié)果呈陰性，OW7.8基因組中無(wú)hph，M1中sac已被敲除，且標(biāo)記基因hph已整合到基因組上。

圖6 野生型探針雜交

圖7 突變型探針雜交

3 討論與結(jié)論

Southern blot過(guò)程較繁瑣，需注意細(xì)節(jié)頗多，本研究用PCR法制備DIG標(biāo)記探針時(shí)設(shè)計(jì)了6對(duì)特異性引物，經(jīng)優(yōu)化選擇出兩對(duì)特異性高且擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度適宜的引物，發(fā)現(xiàn)若擴(kuò)增產(chǎn)物低于300 bp，則DIG摻入較少，而探針過(guò)長(zhǎng)則DIG摻入過(guò)多，導(dǎo)致非特異性雜交。張明琴等[8]用900 bp探針進(jìn)行雜交，雜交信號(hào)較強(qiáng)。另外，在探針標(biāo)記前要優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，包括引物、退火溫度、延伸時(shí)間、模板量等，減少非特異性擴(kuò)增，從而降低雜交背景值，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性。

Southern blot對(duì)基因組DNA的質(zhì)量要求高，本研究在CTAB法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)[9]，菌絲研磨要充分快速（2 min內(nèi)），避免降解；渦旋振蕩使菌絲與裂解液混勻，使DNA充分釋放。對(duì)裂解時(shí)間也進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)40 min利于基因組DNA釋放。

實(shí)驗(yàn)中在45～65 ℃范圍內(nèi)設(shè)置了5個(gè)溫度，發(fā)現(xiàn)50 ℃時(shí)雜交效果最好。雜交膜的選擇也相當(dāng)重要，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用尼龍膜比硝酸素纖維膜的雜交信號(hào)強(qiáng)。雜交液純度也會(huì)影響雜交結(jié)果，分別用過(guò)濾前后的雜交液進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)過(guò)濾后的雜交背景低、無(wú)假陽(yáng)性、雜交信號(hào)較強(qiáng)，而未過(guò)濾雜交液則背景值高、無(wú)雜交信號(hào)。雜交膜用TE漂洗2次后封存，膜干燥或久置后，信號(hào)將會(huì)有所減弱或褪色，但經(jīng)TE潤(rùn)濕后仍然會(huì)重現(xiàn)原有的雜交信號(hào)[10]。

Hyb高效雜交液適合在帶正電荷尼龍膜上進(jìn)行Southern和Northern雜交分析，其獨(dú)特配方和操作規(guī)程僅需雜交6～12 h，而常規(guī)雜交則需要12～24 h。另外，Hyb高效雜交液能明顯降低背景，使Southern膜上單拷貝基因和Northern膜上低拷貝RNA得以檢出，也適于各類(lèi)cDNA表達(dá)芯片雜交和探針標(biāo)記。

設(shè)計(jì)DIG標(biāo)記探針，利用Southern blot技術(shù)檢測(cè)了小花棘豆內(nèi)生真菌OW7.8和M1菌株，結(jié)果表明OW7.8中有sac中間序列，而在M1中被hph替換，說(shuō)明sac已被敲除。sac基因以單拷貝形式存在于OW7.8基因組中。