膜分離技術(shù)純化蔓三七葉多糖的研究

李華勇，胡居吾

（1.江西省吉安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西吉安 343000；2.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

蔓三七，又名平臥菊三七，為多年生草本藥食兩用植物。蔓三七莖葉營(yíng)養(yǎng)豐富，富含粗多糖和綠原酸等成分。民間利用其消炎止咳、通經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛，可用于肺結(jié)核、支氣管肺炎等疾病的治療[1]?，F(xiàn)代生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究證明，蔓三七具有消炎止咳、散淤消腫[2]、提高人體免疫力[3]、降血糖、降血壓和抑制乙型肝炎等效果[4]。另一方面，蔓三七具有極好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種藥食兼可的獨(dú)特植物，與木耳菜同屬。食味柔滑、清香可口，可清炒、涼拌、氽湯，其葉也可生吃，或取鮮葉開(kāi)水沖泡當(dāng)茶飲，是一種高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的“藥食兩用”植物。

多糖具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)及豐富的生物活性，包括抗腫瘤[5]、抗炎[6]、抑制血管生成[7]、抗感染[8]、改善免疫功能[9]、調(diào)節(jié)血糖血脂[10]、保肝[11]等多種功效。

通過(guò)前期對(duì)蔓三七葉化學(xué)成分的研究，發(fā)現(xiàn)多糖類(lèi)物質(zhì)為其主要成分之一，截至目前，關(guān)于蔓三七多糖的研究一直處于空白，嚴(yán)重制約了蔓三七這一植物的綜合利用。

傳統(tǒng)多糖提純方法（如鹽析法等）操作耗時(shí)、耗能，超濾技術(shù)借助化學(xué)、物理或能量等外力差異，以膜孔徑的大小進(jìn)行液體中物質(zhì)的分離和純化[12]，不需要加熱或添加化學(xué)試劑，具有條件溫和、分離精度高、成本低、環(huán)保等特點(diǎn)，在植物多糖分離純化方面有著良好的應(yīng)用前景[13]。

本研究以蔓三七葉為原料，對(duì)蔓三七葉多糖的工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)濾工藝進(jìn)行研究，目的是獲得蔓三七葉多糖生產(chǎn)相關(guān)超濾工藝參數(shù)，為促進(jìn)蔓三七葉多糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔓三七葉由江西華紫仁農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司提供，經(jīng)烘干、粉碎后過(guò)20目篩備用。無(wú)水葡萄糖，標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；苯酚、硫酸均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

圖1所示為膜分離設(shè)備圖，浙江賽特膜技術(shù)有限公司生產(chǎn)；超濾膜，膜濾材質(zhì)為復(fù)合膜，膜面積1m2；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；METTLER-TOLEDOAL104型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q型超純水制備系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DZF-6090Z型真空干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

圖1 膜分離系統(tǒng)試驗(yàn)裝置圖

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 膜分離純化工藝流程

采用膜技術(shù)分離純化蔓三七多糖的工藝流程如圖2所示。

圖2 膜分離純化工藝流程

1.3.2 蔓三七葉粗多糖提取液工藝

取烘干、粉碎后的蔓三七葉，按料液比1∶15（g/mL）加入蒸餾水，于65℃恒溫水浴下提取2.5h，離心、抽濾，濾渣部分繼續(xù)用同樣方法浸提，上清液合并濃縮后緩慢加入4倍體積的無(wú)水乙醇沉淀粗多糖，于4 ℃下低溫靜置24 h，再以4800 r/min離心10 min，收集下層粗多糖沉淀，最后用無(wú)水乙醇洗滌2次，沉淀物用65℃超純水溶解，備用，用于超濾實(shí)驗(yàn)[14]。

1.3.3 蔓三七葉提取液純化實(shí)驗(yàn)

采用超濾膜主要去除蔓三七葉提取液中分子量較小的無(wú)機(jī)小分子等。其中，膜孔徑是影響膜分離中目標(biāo)產(chǎn)物收率和含量大小的關(guān)鍵因素。通過(guò)研究蔓三七葉多糖分子量及組成，發(fā)現(xiàn)其分子量主要集中在1000KD以上。因此，選用截留分子量為1000KD的超濾膜進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)超濾膜截留液和透過(guò)液濃縮、干燥。操作溫度和壓力對(duì)膜分離過(guò)程和膜通量有顯著的影響。因此，本試驗(yàn)以固收率、蔓三七葉多糖含量和膜通量為性能指標(biāo)，考察流量、溫度、時(shí)間和壓力對(duì)膜分離純化過(guò)程的影響。其中膜通量計(jì)算公式為：

式中，Q為膜通量，L/(min·m2)；V為超濾液體積，L；A為有效膜面積，m2；T為超濾時(shí)間，min。

1.3.4 超濾單因素試驗(yàn)

以料液膜通量作為試驗(yàn)指標(biāo)，研究不同流量（15 mL/min、25 mL/min、35 mL/min、45 mL/min、55 mL/min）、不同溫度（10℃、20℃、30℃、40℃、50℃）、不同時(shí)間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）、不同壓力（50kPa、80kPa、110kPa、140kPa、170kPa）對(duì)超濾效果的影響。

1.3.5 超濾正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考慮到過(guò)濾成本和產(chǎn)品質(zhì)量，固定料液流量為35mL/min，以操作溫度、時(shí)間和壓力為自變量，膜通量為試驗(yàn)指標(biāo)，對(duì)蔓三七葉多糖提取液的超濾工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定L9(34)的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，選用因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.6 超濾驗(yàn)證

通過(guò)超濾工藝的單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)分析結(jié)果確定蔓三七葉多糖生產(chǎn)中過(guò)濾工藝的最佳參數(shù)，依據(jù)最佳工藝參數(shù)進(jìn)行蔓三七葉多糖提取液的超濾驗(yàn)證，平行3份，測(cè)定蔓三七葉多糖的膜通量。

1.3.7 蔓三七葉多糖含量測(cè)定[14]

1.3.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及其對(duì)應(yīng)的吸光度，得到苯酚-硫酸法的回歸方程為y=7.55x-0.078，R2=0.9994，表明總糖在0.021～0.166 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.7.2 粗多糖含量測(cè)定

精密稱取樣品10 mg，加超純水定容至25 mL，即得0.4 mg/mL的供試品溶液。取適量樣品溶液，平行3份，按1.3.7.1的操作方法測(cè)定樣品中的總糖含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用Origin 8.0軟件作圖，SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾工藝條件的確定

2.1.1 流量對(duì)超濾效果的影響

流量對(duì)超濾效果的影響見(jiàn)圖3，蔓三七葉多糖提取液的膜通量隨著進(jìn)料流量的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，在流量為35 mL/min時(shí)，蔓三七葉多糖提取液的膜通量最大，達(dá)0.88 L/(min·m2)。伴隨進(jìn)料流量的繼續(xù)增大，蔓三七葉多糖提取液的膜通量有下降的趨勢(shì)。因?yàn)樵谠黾恿弦旱耐牧鞒潭韧瑫r(shí)，也可降低溶質(zhì)在膜層的濃度，減輕對(duì)凝膠層的影響。因此，考慮到超濾效率，選擇料液流量為35 mL/min。

圖3 流量對(duì)超濾效果的影響

2.1.2 溫度對(duì)超濾效果的影響

溫度對(duì)超濾效果的影響見(jiàn)圖4，蔓三七葉多糖提取液的膜通量隨溫度升高呈不斷上升的趨勢(shì)，在提取液的溫度為50℃時(shí)，蔓三七葉多糖提取液的膜通量最高，達(dá)為0.89 L/(min·m2)，比提取液的溫度為30℃時(shí)高了14.6%，比20℃高了37.07%。其原因是，由于提取液溫度的升高，料液粘度下降，流動(dòng)性增強(qiáng)，膜通量也隨之變大。但是，當(dāng)提取液溫度高于40℃，膜通量增加的速率逐漸變小，因?yàn)榇藭r(shí)膜表面對(duì)大分子溶質(zhì)的吸附隨溫度升高而增加，致使凝膠層逐漸加厚，膜孔堵塞，導(dǎo)致超濾效果降低。因此，考慮到濾膜的使用壽命和超濾效果，確定提取液溫度為40℃。

圖4 溫度對(duì)超濾效果的影響

2.1.3 超濾時(shí)間對(duì)超濾效果的影響

超濾時(shí)間對(duì)超濾效果的影響見(jiàn)圖5，蔓三七葉多糖提取液的膜通量隨超濾時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降，超濾時(shí)間在5 min時(shí)，蔓三七葉多糖提取液的膜通量為0.90 L/(min·m2)；超濾時(shí)間在10 min時(shí)，蔓三七葉多糖提取液的膜通量為0.84 L/(min·m2)；超濾時(shí)間在15 min時(shí)，蔓三七葉多糖提取液的膜通量為0.71 L/(min·m2)；隨著超濾時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，膜通量下降逐漸加快，這是因?yàn)榘l(fā)生了濃度差極化，許多大分子溶質(zhì)會(huì)富集在膜表面，影響料液的超濾效率。因此，考慮到超濾效益，超濾時(shí)間定為10 min。

圖5 時(shí)間對(duì)超濾效果的影響

2.1.4 超濾壓力對(duì)超濾效果的影響

超濾壓力對(duì)超濾效果的影響見(jiàn)圖6，蔓三七葉多糖提取液的膜通量隨超濾壓力升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)超濾壓力為110 kPa時(shí)，蔓三七葉多糖提取液的膜通量最高，為0.86L/(min·m2)。在壓力小于110kPa時(shí)，增大超濾壓力，會(huì)增加膜分離過(guò)程中的推動(dòng)力，使膜通量增大；當(dāng)壓力超過(guò)110 kPa時(shí)，膜通量略有下降，是因?yàn)榇蠓肿尤苜|(zhì)在膜表面富集，凝膠層的厚度和密度相應(yīng)增加，因而會(huì)影響超濾效率。因此，選擇壓力為110kPa。

圖6 壓力對(duì)超濾效果的影響

2.2 超濾正交分析

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，各超濾試驗(yàn)因素對(duì)蔓三七葉多糖提取液的超濾效果的影響依次為超濾時(shí)間＞超濾壓力＞超濾溫度，且最佳組合為A3B1C1，即超濾溫度 45℃、超濾時(shí)間8min、超濾壓力90kPa。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析見(jiàn)表3，各超濾試驗(yàn)因素對(duì)超濾效果的影響是顯著的，說(shuō)明該方程能很好地整合蔓三七葉多糖超濾的條件。因而最終確定的最佳超濾工藝參數(shù)為進(jìn)料流量35 mL/min，超濾溫度45℃、超濾時(shí)間8min、超濾壓力90kPa。

表3 方差分析

2.3 超濾工藝驗(yàn)證

由表4可知，在最佳超濾工藝條件下，蔓三七葉多糖膜通量為0.85L/(min·m2)，產(chǎn)品得率為10.0%，產(chǎn)品純度為80.9%，重現(xiàn)性良好。

表4 超濾工藝驗(yàn)證

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗(yàn)確定蔓三七葉多糖的最優(yōu)超濾工藝條件為進(jìn)料流量35 mL/min，超濾溫度45℃、超濾時(shí)間8min、超濾壓力90kPa。蔓三七葉多糖膜通量可過(guò)0.85 L/(min·m2)，產(chǎn)品得率為10.0%，產(chǎn)品純度為80.9%。