清源，周潔，尹勝，張萬明*

1(西昌學(xué)院 農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川 西昌，615013) 2(會東高川天源農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 會東，615200)

塊菌(truffle)是一類與樹木共生的地下真菌的統(tǒng)稱，商業(yè)上也叫做松露。在生物學(xué)分類上隸屬于真菌界(Eumycetes)、子囊菌亞門(Ascomycotina)、塊菌目(Tuberales)、塊菌科(Tuberaceae)、塊菌屬(Tuber)[1]。在國外，塊菌主要分布在北緯 40°～47°，海拔 100～1 000 m的地區(qū)。其中，法國北溫帶的科梅爾西、意大利和西班牙的溫帶地區(qū)等最為廣泛。常見的塊菌有黑孢塊菌(Tubermelanosporum)、意大利白塊菌(T.magnatum)、印度塊菌(T.indicum)等，通常與多種宿主樹種如法國的橡樹(Quercuspubescens)、櫟樹(Q.ilex)、榛子樹(Corylusavellana)等共生[2]。塊菌價格昂貴，每千克達(dá)1000 美元仍然供不應(yīng)求，在法國、美國和意大利塊菌均享有“地下黃金”和“廚房里鉆石”的美譽(yù)[3]。

在我國，塊菌主要成熟于每年 10～12月。據(jù)調(diào)查，集中成熟和采收過后的塊菌，由于保鮮方法不當(dāng)所造成的損失率可超過 30%。塊菌采后由于具有生理后熟作用，仍然能進(jìn)行呼吸作用，加上子實(shí)體表面沒有明顯的保護(hù)結(jié)構(gòu)，容易蒸騰失水，且易受到微生物的侵染而腐爛變質(zhì)，失去色、香、味等，造成品質(zhì)下降，為塊菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，國內(nèi)外對塊菌儲藏的方法主要是低溫保鮮。研究顯示，在不發(fā)生冷害的情況下，塊菌子實(shí)體的保鮮時間隨著溫度的下降而延長，其香氣成分也能更好地保留[4-7]。但是，目前卻鮮有關(guān)于塊菌的保鮮劑貯藏效果研究的報道[8]。因此，研究開發(fā)成本低、方便操作、安全有效的塊菌保鮮劑，具有重要的應(yīng)用前景。

油橄欖(Oleaeuropaea)又名齊墩果，是世界著名的木本油料樹種。20世紀(jì) 60 年代，國內(nèi)開始大量引種，主栽地區(qū)涉及四川、甘肅、廣西、湖北等地[9]。油橄欖鮮果被開發(fā)利用和榨油的過程中，產(chǎn)生的大量加工下腳料(枝、葉)卻未被利用。研究顯示，油橄欖枝葉中含有大量的酚類物質(zhì)，具有抗菌、抗氧化等作用，卻鮮有應(yīng)用方面的報道[10-13]。殼聚糖是以自然界中廣泛存在的甲殼素(chitin)為原料，經(jīng)過脫乙酰作用得到的，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一天然堿性多糖，具有很好的抑菌效果和成膜性，被廣泛用于水果、蔬菜以及肉類的保鮮中，具有較高的研究價值[14-17]。因此，本試驗以印度塊菌為研究對象，探討橄欖葉提取物和殼聚糖復(fù)配對其保鮮效果的影響，為開發(fā)天然保鮮劑提供參考，也可為油橄欖樹枝葉的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮印度塊菌：采自涼山州會東縣，挑選成熟度一致、無機(jī)械損傷、無病蟲害、大小基本一致的子實(shí)體進(jìn)行試驗。

橄欖葉粗提物，實(shí)驗室自提(多酚含量為 100 mg/g)；殼聚糖(脫乙酰度>90%)，索萊寶試劑公司；濃硫酸、苯酚、葡萄糖、2，6-二氯靛酚、草酸、抗壞血酸、氯化鋇、酚酞、NaOH等均為分析純，西昌迪安實(shí)業(yè)公司。

1.2 主要儀器

Tu1810紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ME203TE電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SHB-B95真空抽濾機(jī),上海振捷實(shí)驗設(shè)備有限公司；79-2恒溫磁力攪拌器,常州國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 橄欖葉粗提物濃度初篩及抑菌活性測定

1.3.1.1 橄欖葉粗提物質(zhì)量濃度初篩

配制質(zhì)量濃度為 10、20、30、40、50 g/L的橄欖葉粗提物溶液，將塊菌在溶液中浸漬 20 s，取出風(fēng)干，用 PE 保鮮膜包裹，于 4 ℃條件下貯藏。以無菌水處理的塊菌為空白對照，儲藏到第10天取樣測定其失重率和總糖含量。

1.3.1.2 橄欖葉粗提物抑菌活性測定

采用濾紙片法，驗證最佳濃度橄欖葉粗提物對大腸桿菌、金黃色普通球菌、白色念珠菌的抑菌活性。將 5×108CFU/mL各菌懸液在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面均勻涂抹 3 次，靜置 15 min后，把吸有 10 μL提取液的滅菌濾紙圓片貼于涂布好菌液的培養(yǎng)基上，以去離子水為對照，每組 5 個平板，每個平板 3 個濾紙片，于 37 ℃培養(yǎng) 18 h后，測量抑菌圈直徑并進(jìn)行比較。

1.3.2 殼聚糖濃度初篩

配制質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25 g/L的殼聚糖溶液，并添加適量摩爾濃度為0.1 mol/L的乙酸溶液，置于磁力攪拌器上攪拌，使其充分溶解。將塊菌在溶液中浸漬20 s，取出風(fēng)干，用PE保鮮膜包裹，于4 ℃條件下貯藏。以無菌水處理的塊菌為空白對照，儲藏到第10天取樣測定其失重率和總糖含量。

1.3.3 復(fù)配保鮮劑的配方篩選

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以橄欖葉粗提物濃度和殼聚糖濃度進(jìn)行兩兩復(fù)配，以無菌水處理的塊菌為空白對照，每隔 5 d 測定失重率、總糖、Vc含量及呼吸強(qiáng)度，復(fù)配保鮮劑配方見表1。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 失重率及質(zhì)量保留率

采用稱重法統(tǒng)計失重率[18]如公式(1)，公式(2)所示:

(1)

質(zhì)量保留率/%=100%-失重率

(2)

1.4.2 總糖含量

采用硫酸苯酚比色法測定[19]。

1.4.3 Vc含量的檢測

采用2，6-二氯酚靛酚法測定[20]。

1.4.4 呼吸強(qiáng)度的檢測

采用靜置法測定，室溫下借助干燥器代替呼吸室[21]。

1.5 貨架期品質(zhì)變化模型

大多數(shù)食品的質(zhì)量與時間關(guān)系表現(xiàn)出零級或一級的反應(yīng)[22]。其中，零級和一級動力學(xué)方程分別按公式(3)，公式(4)計算：

Q=Q0-k1t

(3)

Q=Q0exp(-k2t)

(4)

式中：Q，t時刻塊菌的某項指標(biāo)測定值；k，塊菌的某項指標(biāo)測變化速率常數(shù)；Q0，塊菌的某項指標(biāo)測初始值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

本試驗用 SPSS 20.0 進(jìn)行方差分析和多重比較，塊菌貨架期品質(zhì)變化模型中參數(shù)值用MATLAB 2014估計。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖葉粗提物濃度對塊菌保鮮效果的影響

不同濃度橄欖葉粗提物處理的塊菌在 4 ℃條件下貯藏 10 d 后的失重率和總糖含量變化如圖1 所示。橄欖葉粗提物質(zhì)量濃度在 20～40 g/L 時，與對照組相比，塊菌失重率較低，而總糖含量較高。通過多重比較分析可知，橄欖葉提取物各試驗組與對照組均呈顯著性差異(P<0.05)，其中橄欖葉粗提物濃度為 30 g/L 時，塊菌的失重率最低，總糖含量最高。

2.2 橄欖葉粗提物的抑菌活性分析

橄欖葉粗提物溶液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌試驗結(jié)果見表2。30 g/L 橄欖葉粗提物溶液有明顯抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的作用，抑菌圈直徑均高于去離子水組(P<0.05)。其中，對金黃色葡萄球菌的抑制作用高于大腸桿菌。

注：與去離子水組比較*表示P<0.05。

2.3 殼聚糖濃度對塊菌保鮮效果的影響

不同濃度殼聚糖處理的塊菌在 4 ℃條件下貯藏 10 d 后的失重率和總糖含量變化如圖2所示。殼聚糖質(zhì)量濃度在5～25 g/L時，與對照組相比，塊菌失重率較低，而總糖含量較高。通過多重比較分析可知，殼聚糖各試驗組與對照組均呈顯著性差異(P<0.05)。其中，殼聚糖質(zhì)量濃度為10和15 g/L 時，塊菌的失重率最低，且無顯著性差異，而殼聚糖質(zhì)量濃度為15 g/L時，塊菌總糖含量最高則更優(yōu)。

2.4 復(fù)配保鮮劑的配方優(yōu)化

2.4.1 復(fù)配保鮮劑對塊菌失重率的影響

由表3 可知，隨著儲藏天數(shù)的增加，各組塊菌的失重率也增加。但是，對照組塊菌的失重率增加速度最快，與各試驗組相比呈顯著性差異(P<0.05)。

注：與試驗組比較，*表示差異顯著(P<0.05)。

由此可見，橄欖葉粗提物與殼聚糖復(fù)配的保鮮劑能有效減少儲藏過程中塊菌水分的流失，延緩失重率的增加。其中，試驗 4 組在第20天的失重率僅為 1.24%，較其他組更低。利用各試驗組第20天的失重率進(jìn)行交叉分組的兩因素方差分析，橄欖葉粗提物與殼聚糖的交互作用如圖3 所示，當(dāng)橄欖葉粗提物濃度為 20 g/L、殼聚糖濃度為 15 g/L 時，塊菌失重率最低，為最佳復(fù)配組合。

2.4.2 復(fù)配保鮮劑對塊菌總糖含量的影響

由表4 可知，隨著儲藏天數(shù)的增加，各組塊菌的總糖含量下降。與對照組相比，第 9 組無顯著性差異，其他各試驗組均呈顯著差異(P<0.05)。橄欖葉粗提物與殼聚糖復(fù)配的保鮮劑能有效降低塊菌的代謝率，降低總糖含量的損失。其中，試驗4組在第20天的總糖含量為1.93%，較其他組更高。

注：與對照組比較*P<0.05

利用各試驗組第20天的總糖含量進(jìn)行交叉分組的兩因素方差分析，橄欖葉粗提物與殼聚糖的交互作用如圖4所示，當(dāng)橄欖葉粗提物濃度為20 g/L、殼聚糖濃度為15 g/L時，塊菌總糖含量最高，為最佳復(fù)配組合。

2.4.3 復(fù)配保鮮劑對塊菌Vc含量的影響

由表5可知，隨著儲藏天數(shù)的增加，各組塊菌的 Vc 含量下降。與對照組相比，第 7、8、9 組無顯著性差異，其他各試驗組均呈顯著差異(P<0.05)。橄欖葉粗提物與殼聚糖復(fù)配的保鮮劑可以有效的抑制塊菌在儲藏期間 Vc 的分解。其中，試驗 4 組在第20天的 Vc 含量為 1.8 mg/100 g，較其他組更高。

注：與對照組比較*P<0.05

利用各試驗組第20天的Vc含量進(jìn)行交叉分組的兩因素方差分析，橄欖葉粗提物與殼聚糖的交互作用如圖5所示，當(dāng)橄欖葉粗提物濃度為20 g/L、殼聚糖濃度為15 g/L時，塊菌Vc含量最高，為最佳復(fù)配組合。

2.4.4 復(fù)配保鮮劑對塊菌呼吸強(qiáng)度的影響

由表6可知，隨著儲藏天數(shù)的增加，各組塊菌的呼吸強(qiáng)度也增加，而對照組塊菌的呼吸強(qiáng)度上升速度最快。與對照組相比，橄欖葉粗提物與殼聚糖復(fù)配的保鮮劑能抑制塊菌的呼吸作用，但無顯著性差異。其中，試驗3組在第20天的呼吸強(qiáng)度為161 mg/(kg·h)，較其他組更低。

利用各試驗組第20天的Vc含量進(jìn)行交叉分組的兩因素方差分析，橄欖葉粗提物與殼聚糖的交互作用如圖6所示，當(dāng)橄欖葉粗提物濃度為40 g/L、殼聚糖濃度為10 g/L時，塊菌的呼吸強(qiáng)度最低。結(jié)合儲藏過程中失重率、總糖含量、Vc含量的變化，確定最佳復(fù)配組合為橄欖葉粗提物20 g/L、殼聚糖 15 g/L。

2.5 復(fù)配保鮮劑對塊菌貨架期品質(zhì)變化模型的預(yù)測結(jié)果

通過 MATLAB 軟件對塊菌的質(zhì)量保留率、總糖含量、Vc 含量和呼吸強(qiáng)度進(jìn)行貨架期擬合。其中，在儲藏期內(nèi)塊菌質(zhì)量保留率的變化符合零級動力學(xué)模型，Vc 含量的變化符合一級動力學(xué)模型。因此，以質(zhì)量保留率、Vc 含量計算最佳復(fù)配保鮮劑處理后，塊菌的貨架期如表7 所示。以塊菌質(zhì)量保留率下降3%為品質(zhì)終點(diǎn)時的貨架期為44 d，與對照組相比，貨架期延長了36 d；以塊菌Vc含量下降50%為品質(zhì)終點(diǎn)時的貨架期為 21 d，與對照組相比，貨架期延長了11 d。分析結(jié)果表明，橄欖葉粗提物 20 g/L，殼聚糖 15 g/L的復(fù)配保鮮劑能有效地對塊菌進(jìn)行保鮮，提升品質(zhì)，延長塊菌的貨架期。

3 結(jié)論

本試驗主要研究橄欖葉粗提物與殼聚糖復(fù)配的復(fù)合保鮮劑對塊菌保鮮效果的影響。以塊菌的失重率和總糖含量為指標(biāo)，通過單因素試驗篩選，確定最佳橄欖葉粗提物濃度為 30 g/L，最佳殼聚糖濃度為 15 g/L。通過抑菌試驗研究發(fā)現(xiàn)，30 g/L 橄欖葉提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有顯著的抑制效果(P<0.05)，對金黃色葡萄球菌的抑制作用高于大腸桿菌，具有作為天然抑菌保鮮劑研究和開發(fā)的價值。由于復(fù)配處理的最佳組合并非單個最佳劑量的簡單相加，而常表現(xiàn)出不同用量的協(xié)同增效作用，因而兩兩組合采用單因素試驗獲得的最好水平并適當(dāng)擴(kuò)大劑量范圍。

通過復(fù)配試驗研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)橄欖葉粗提物濃度為20 g/L、殼聚糖為 15 g/L 時能有效提升塊菌在儲藏過程中的品質(zhì)，降低塊菌失重率和呼吸強(qiáng)度，維持其總糖含量和 Vc 含量。對該配方的貨架期預(yù)測顯示，與未處理塊菌相比，以質(zhì)量保留率下降 3% 為品質(zhì)終點(diǎn)的貨架期預(yù)計可延長 36 d，以 Vc 含量下降 50% 為品質(zhì)終點(diǎn)的貨架期預(yù)計可延長 11 d，具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的價值。