施辰, 曹海霞, 婁芮, 徐陳欣, 馮繼鋒

1 LncRNA概述

70%的人類基因組能夠被轉(zhuǎn)錄,但只有不到2%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有編碼蛋白質(zhì)的功能,其余的98%均為非編碼RNA(noncoding RNA, ncRNA),根據(jù)核苷酸序列的長(zhǎng)度,ncRNA可分為短鏈ncRNA(short/small ncRNA)和長(zhǎng)鏈ncRNA(long ncRNA,LncRNA),二者之間并沒有特別嚴(yán)格的界限,僅以ncRNA核苷酸序列的長(zhǎng)度來區(qū)分,一般將長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的ncRNA定義為L(zhǎng)ncRNA[1]。LncRNA分布廣泛,在動(dòng)物、植物、酵母甚至病毒中均發(fā)現(xiàn)有LncRNA存在,其功能幾乎涉及到生物體生理及病理的全部生物學(xué)過程,既能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及代謝等生理過程,也參與調(diào)節(jié)機(jī)體的各種病理過程,如癌癥、糖尿病、免疫病、阿爾茨海默病等[2]。盡管在過去20多年里,也有關(guān)于LncRNA的一些報(bào)道,但高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展才使得從基因水平研究LncRNA成為可能[3]。為了更深入地開展LncRNA的相關(guān)研究,了解其功能及作用機(jī)制,科學(xué)家們根據(jù)LncRNA在基因組中所處的位置及背景,將其分為5種類型,即正義、反義、雙向、基因內(nèi)及基因間LncRNA[4-5]。

目前關(guān)于LncRNA相關(guān)功能的研究中,最深入的便是其在癌癥中的作用。在正常的生理?xiàng)l件下,LncRNA的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控。相反,在許多癌癥的發(fā)生發(fā)展中均伴隨著LncRNA的異常表達(dá),它們既可以作為原癌基因促進(jìn)腫瘤的生成,亦可作為抑癌基因來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等[6]。因此,LncRNA可以成為癌癥的特異性標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[7]。一項(xiàng)對(duì)膀胱癌患者組織進(jìn)行芯片分析的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),有3 324個(gè)LncRNA發(fā)生了異常表達(dá),且這些LncRNA表達(dá)與健康對(duì)照組相比,差異倍數(shù)≥2,其中有110個(gè)LncRNA表達(dá)差異非常明顯,與健康對(duì)照組相比,差異倍數(shù)≥8。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明,LncRNA TNXA、CTA.134P22.2、CTC.276P9.1及KRT19P3變化與芯片數(shù)據(jù)高度一致[8]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19在膀胱癌組織中高表達(dá),上調(diào)LncRNA H19可加速膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,其機(jī)制可能是LncRNA H19通過與果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源物2(EZH2)結(jié)合后激活Wnt/β連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路,并下調(diào)鈣黏附蛋白(E-cadherin)的表達(dá)來促進(jìn)膀胱癌的轉(zhuǎn)移[9]。除了膀胱癌,LncRNA H19在前列腺癌中還可以通過LncRNA H19-miR675軸調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)蛋白(TGFβI),從而抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移[10]。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA AFAP1.AS1在食管腺癌及其癌前病變巴雷特食管中都呈高表達(dá),而當(dāng)小干擾RNA將LncRNA AFAP1.AS1沉默時(shí),則能抑制食管腺癌細(xì)胞的分化、侵襲及轉(zhuǎn)移[11]?？傊?LncRNA是真核生物轉(zhuǎn)錄本中非常重要的組成部分,它在機(jī)體的生理及病理過程中均發(fā)揮著極其重要的作用。

2 鉑類藥物

鉑類藥物是一類非特異性細(xì)胞周期抗腫瘤藥物,目前在臨床治療中應(yīng)用中較多的有順鉑、卡鉑、奧沙利鉑。這類藥物可以通過影響腫瘤細(xì)胞DNA的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮抗癌作用[12]。鉑類藥物進(jìn)入細(xì)胞后先發(fā)生解離失去酸根負(fù)離子,再結(jié)合兩分子的水,形成帶正電荷的水合鉑。這個(gè)帶正電荷的水合鉑可以和細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合。其中DNA嘌呤堿基上的N7位點(diǎn)又是鉑類抗腫瘤藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn),從而形成鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)分子間交聯(lián),其中又以鏈內(nèi)配對(duì)交聯(lián)為主,所有的交聯(lián)都會(huì)使DNA鏈發(fā)生局部扭轉(zhuǎn)或解旋,進(jìn)而造成DNA損傷,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期阻滯或細(xì)胞凋亡[13-14]。由于上述鉑類藥物與細(xì)胞內(nèi)各組分的非特異性結(jié)合以及鉑類藥物損傷DNA、誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的多樣性,使得腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的耐藥性可以經(jīng)由多種途徑發(fā)生,腫瘤細(xì)胞的耐藥性也成為影響化療效果和腫瘤根治的主要障礙[15]。腫瘤耐藥分為原藥耐藥(primary drug resistance,PDR)和多藥耐藥(multidrug resistance,MDR),PDR指腫瘤細(xì)胞對(duì)已使用過的藥物產(chǎn)生了耐藥作用,而MDR指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生耐藥后,又對(duì)其他不同作用機(jī)制的藥物也產(chǎn)生了耐藥,MDR可出現(xiàn)在多種惡性腫瘤疾病中,如卵巢癌、胃癌、大腸癌、肺癌等。而鉑類抗腫瘤藥物結(jié)構(gòu)上的相似性使得耐藥性或交叉耐藥性成為限制其臨床應(yīng)用的主要障礙之一[14]。鉑類藥物耐藥的途徑主要有4種:① 藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)降低,使藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蓄積減少;② 細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(glutathione,GSH)和金屬硫蛋白(metallothionein,MT)濃度增加,使鉑類藥物代謝失活;③ DNA損傷修復(fù)功能增強(qiáng),腫瘤細(xì)胞忽略鉑類藥物導(dǎo)致的DNA損傷而繼續(xù)增殖;④ 細(xì)胞凋亡功能受抑制,腫瘤細(xì)胞無法通過凋亡通路被殺滅[16-17]。

3 LncRNA參與腫瘤鉑類藥物耐藥的機(jī)制

腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性是化療失敗的主要原因之一。不管是先天性耐藥還是后天獲得性耐藥,細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的異常激活均與腫瘤耐藥性密切相關(guān)[18]。近年研究發(fā)現(xiàn),LncRNA可在染色體修飾、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后水平方面廣泛地對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,并參與X染色體沉默、基因組印記、核內(nèi)運(yùn)輸和轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾等調(diào)控過程,從而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡,并導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲遷移等一系列活動(dòng)[19]。LncRNA對(duì)腫瘤耐藥的相關(guān)作用機(jī)制較復(fù)雜,主要有以下幾類。

3.1 LncRNA通過調(diào)控信號(hào)通路引起細(xì)胞周期的改變?cè)斐赡退?研究發(fā)現(xiàn),LncRNA可以通過影響腫瘤細(xì)胞周期造成耐藥[20]。比如在骨肉瘤組織中LncRNA HOTTIP明顯高于正常組織;用不同劑量的順鉑處理骨肉瘤細(xì)胞,HOTTIP高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期,促使細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥;其機(jī)制為HOTTIP通過激活Wnt/β-catenin途徑來增加骨肉瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[21]。LncRNA HOTAIR是第1個(gè)發(fā)現(xiàn)的具有反式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用的LncRNA,其在多種惡性腫瘤中高表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)與親本肺腺癌細(xì)胞系(A549)相比,HOTAIR在順鉑耐藥的肺腺癌細(xì)胞系(A549/DDP)中的表達(dá)顯著上調(diào),因此HOTAIR可作為腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的預(yù)測(cè)因子[13,22]。HOTAIR亦可通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路使細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥,而敲除HOTAIR則對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路產(chǎn)生抑制,使細(xì)胞周期停滯在G0期,細(xì)胞的增殖能力下降,使化療敏感性增強(qiáng)[22-23]。另一項(xiàng)研究報(bào)道指出LncRNA MEG3在順鉑耐藥的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP中的表達(dá)明顯下降,升高M(jìn)EG3的表達(dá)可抑制肺腺癌細(xì)胞增殖,其機(jī)制也是通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯,從而增加A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度,抑制腫瘤的進(jìn)展[24]。

3.2 LncRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡 一些腫瘤化療藥物是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),所以凋亡調(diào)節(jié)失控也可引起耐藥的發(fā)生。LncRNA可以通過上調(diào)Bcl-2、核因子-κB(NF-κB)、凋亡抑制蛋白(IAP)等促生存因子獲得凋亡抗性,或者抑制半胱氨酸蛋白酶(caspase)、p53等抑癌基因表達(dá)產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性鉑類耐藥卵巢腫瘤的LncRNA HOTAIR表達(dá)水平高于原發(fā)性卵巢腫瘤,并且HOTAIR的上調(diào)可以誘導(dǎo)卵巢癌發(fā)生鉑類耐藥。其機(jī)制是HOTAIR使DNA損傷修復(fù)持續(xù)激活,促進(jìn)NF-κB表達(dá)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)分泌以及活化細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(CHK1)-p532-p2途徑,從而抑制細(xì)胞凋亡,產(chǎn)生化療耐藥性。在DNA損傷修復(fù)期間,驅(qū)動(dòng)NF-κB-HOTAIR軸正反饋環(huán)級(jí)聯(lián)有助于增加細(xì)胞凋亡和化療敏感性。順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞(SKOV-3/DDP、A2780/DDP)比順鉑敏感細(xì)胞(SKOV-3和A2780)的LncRNA PVT1過表達(dá)。已知PVT1與原癌基因MYC共同位于染色體8q24,兩者的表達(dá)與人類原發(fā)腫瘤的產(chǎn)生有關(guān)。PVT1過表達(dá)使轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、p-Smad4、caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,腫瘤細(xì)胞凋亡比例減少,細(xì)胞活力升高造成耐藥,而敲低PVT1可以使TGF-β1、p-Smad4、caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高,腫瘤細(xì)胞凋亡比例增加,細(xì)胞活力降低,進(jìn)而逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥細(xì)胞株的順鉑耐藥性[25]?？梢奝VT1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑參與卵巢癌順鉑耐藥性的產(chǎn)生。此外在泌尿系統(tǒng)腫瘤研究中發(fā)現(xiàn),膀胱癌細(xì)胞中的LncRNA UCA1表達(dá)減少,會(huì)抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,降低順鉑敏感性,而UCA1的過表達(dá)增加了膀胱癌細(xì)胞的化療敏感性,其機(jī)制是UCA1和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)啟動(dòng)子結(jié)合,激活miR-196a-5p表達(dá),miR-196a-5p可以直接靶向p27kip1,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而參與順鉑耐藥[26]。

3.3 LncRNA作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)發(fā)揮耐藥作用 近年來研究發(fā)現(xiàn),LncRNA能以“海綿”吸附方式與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為,因此此類LncRNA被稱為ceRNA,在腫瘤的藥物敏感性中發(fā)揮重要的作用[20,27]。LncRNA UCA1可以通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-204-5p調(diào)控靶基因CREBl/BC12/RAB22A,從而介導(dǎo)MDR[28]。另外在順鉑敏感的骨肉瘤細(xì)胞中,LINC00161通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合和上調(diào)四肽重復(fù)的干擾素誘導(dǎo)蛋白(IFIT2)表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)化療敏感性,而LINC00161在順鉑耐藥細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),則使骨肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生順鉑耐藥性[29]。

3.4 LncRNA通過調(diào)節(jié)耐藥相關(guān)基因及蛋白參與腫瘤細(xì)胞耐藥 多藥耐藥基因1(multidrug resistance gene1,MDR1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance related proteins,MRP)參與了多種腫瘤的鉑類耐藥[30]。LncRNA可以通過靶向調(diào)節(jié)這些耐藥相關(guān)基因參與腫瘤對(duì)鉑類藥物的耐藥機(jī)制。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道INK4基因座的反義LncRNA ANRIL在順鉑耐藥的胃癌細(xì)胞(BGC823/DDP)中表達(dá)升高,且ANRIL的表達(dá)與MRP的表達(dá)呈正相關(guān),通過敲低ANRIL可以抑制MDR1和MRP1的表達(dá),從而抑制胃癌耐藥性的進(jìn)展[31]。此外研究發(fā)現(xiàn)LncRNA PVT1在對(duì)順鉑耐藥的胃癌組織和耐藥細(xì)胞系中呈高表達(dá),敲除PVT1可逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性,qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,PVT1表達(dá)的上調(diào)可以促進(jìn)MDR1的表達(dá),從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞對(duì)化療耐藥的發(fā)生[32]。

3.5 LncRNA通過影響藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體系干擾藥物代謝

藥物外排系統(tǒng)的改變是腫瘤耐藥機(jī)制中最常見的一種。由于藥物流出的增加,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度低于細(xì)胞殺傷閾值從而引起腫瘤耐藥。ATP結(jié)合盒超家族成員(ATP-binding cassette,ABC)是影響化療藥物敏感性的重要藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體,這些蛋白通過利用ATP水解的能量將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出到細(xì)胞外,從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性,尤其對(duì)于MDR的影響極為突出[33]。而LncRNA可以通過調(diào)節(jié)ABC超家族蛋白的表達(dá)從而調(diào)控腫瘤化療耐藥。例如LncRNA MRUL是與胃癌MDR相關(guān)的一種LncRNA,有報(bào)道指出MRUL可以調(diào)節(jié)ABC家族中的細(xì)胞膜P-糖蛋白(P-gp)表達(dá)從而發(fā)揮增強(qiáng)子樣的作用,其可促進(jìn)P-pg的表達(dá)導(dǎo)致相關(guān)化療藥物外排增多、攝入減少,從而促進(jìn)MDR形成,而抑制MRUL可提高化療藥物的敏感性[34]。

3.6 LncRNA可以調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT) EMT是指與基底膜相連的上皮細(xì)胞喪失細(xì)胞極性和細(xì)胞-細(xì)胞間黏附能力,成為間充質(zhì)細(xì)胞,這種生物學(xué)性狀的改變使細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力[35]。多種腫瘤細(xì)胞經(jīng)過化療后會(huì)發(fā)生EMT,這種適應(yīng)性變化的產(chǎn)生使腫瘤細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性耐藥。近年來腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是對(duì)藥物高度耐藥的一類細(xì)胞,且EMT與腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)表型有著密切聯(lián)系[36-37]。LncRNA UCA1位于人類染色體19p13.12,總長(zhǎng)1439 bp,包含3個(gè)外顯子,UCA1可通過調(diào)節(jié)EMT影響腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類化療藥物的敏感度[38]。又有研究指出HOTAIR可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT,其機(jī)制是HOTAIR可以促進(jìn)EZH2過表達(dá)來抑制SCLC細(xì)胞中與EMT相關(guān)的基因表達(dá)[39]。又如在腎細(xì)胞癌中HOTAIR是組蛋白脫甲基酶JMJD3的正向調(diào)節(jié)因子,其可以促進(jìn)靶基因Snail上調(diào),而Snail能促進(jìn)EMT,所以HOTAIR也可以通過組蛋白修飾來介導(dǎo)EMT[40]。

4 小結(jié)與展望

多種LncRNA在化療敏感性和耐藥性細(xì)胞中的表達(dá)不同,它們通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)直接或間接影響化療效果,其引起的鉑類藥物耐藥過程往往不止一種機(jī)制被激活,抑制單一的耐藥信號(hào)通路往往不能使化療效果恢復(fù)到正常水平,因此克服鉑類藥物的耐藥性可能需要同時(shí)針對(duì)多種耐藥機(jī)制才能起作用。LncRNA在癌癥中的特異性表達(dá)使其可以作為癌癥診斷和預(yù)后的標(biāo)志物以及新的治療靶點(diǎn),給未來的腫瘤治療帶來了新希望。