趙 坤， 田相利，2??， 董雙林，2， 蔣雯雯， 李海東

(1海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，山東 青島 266237)

本研究中，分別以氯化銨、亞硝酸鈉和硝酸鈉作為唯一氮源，對一株分離自對蝦養(yǎng)殖池塘底泥的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)菌株MP15的脫氮特性進(jìn)行了詳細(xì)的研究。與此同時，通過測定菌株MP15脫氮過程中的關(guān)鍵酶活性，從酶學(xué)角度理解其脫氮途徑。此外，本研究采用高精度的氣相色譜-同位素比質(zhì)譜(GC-IRMS)同位素示蹤技術(shù)，研究菌株MP15的氮代謝路徑，旨在闡明菌株MP15的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化機制，為其在生物脫氮實踐應(yīng)用中提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 本研究中所用的地衣芽孢桿菌菌株MP15分離自對蝦養(yǎng)殖池塘底泥，目前保藏于中國海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)實驗室微生物保藏中心。菌株MP15的16S rRNA基因序列的GenBank登記號為MH569340[35]。

1.1.2 培養(yǎng)基 2216E培養(yǎng)基：胰蛋白胨 6.0 g、酵母提取物 2.0 g、海水1 000 mL，pH=7.5。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(HNM)：NH4Cl 0.16 g，葡萄糖1.73 g，海水1 000 mL，pH=7.5。

亞硝酸鹽反硝化培養(yǎng)基(NDM)：NaNO20.20 g，葡萄糖1.73 g，海水1 000 mL，pH=7.5。

硝酸鹽反硝化培養(yǎng)基(DM)：NaNO30.26 g，葡萄糖1.73 g，海水1 000 mL，pH=7.5。

上述HNM、NDM和DM培養(yǎng)基，使用前分別于高壓滅菌鍋115 ℃下高溫蒸汽滅菌20 min；2216E培養(yǎng)基使用前于高壓滅菌鍋121 ℃下高溫蒸汽滅菌20 min。

1.2 菌株MP15異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能研究

1.3 對菌株MP15氨氧化過程的抑制研究

1.4 菌株MP15脫氮過程中關(guān)鍵酶活性研究

1.5 15N同位素示蹤測定含氮氣體研究

在本實驗中，分別用15NH4Cl、Na15NO2和Na15NO3(Sigma Corp., USA)替代上述基礎(chǔ)降解液中的NH4Cl、NaNO2和NaNO3。其中以不添加菌液的基礎(chǔ)降解液作為對照組，以添加菌液的不同氮基礎(chǔ)降解液作為不同的實驗組，每個實驗組設(shè)置3個重復(fù)。取對數(shù)期的菌液，按照5%(v:v)的接種量，接種于含有100 mL無菌基礎(chǔ)降解液的500 mL用橡皮塞緊密密封的醫(yī)用輸液瓶中[7]，然后將各處理置于恒溫(28 ℃)搖床連續(xù)振蕩(160 r/min)培養(yǎng)72 h。實驗結(jié)束后，檢測頂空氣體中氮的氣體化合物。樣品的穩(wěn)定同位素比值是在深圳市華科精信檢測科技有限公司與清華大學(xué)深圳研究生院共建的穩(wěn)定同位素實驗室測定，儀器型號為同位素比率質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Finnigan DELTA V Advantage，美國)。氮穩(wěn)定同位素的自然豐度表示為:

式中：N為樣品15N；R為15N/14N；δ15N是相對于N2-atm，分析精度為δ15N<0.3‰。

1.6 實驗方法和計算

1.7 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示。數(shù)據(jù)使用SPSS(SPSS 19.0 version for windows，SPSS，Inc.，Chicago，USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析。通過Kolmogorov-Smirnov檢驗和Levene’s檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢測。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則進(jìn)行進(jìn)一步的分析，若不符合，則首先進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。通過單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析以P<0.05表示各組間存在顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能

圖1 地衣芽孢桿菌MP15以氯化銨作為唯一氮源時的脫氮特性Fig. 1 Nitrogen removal characteristic of B. licheniformis MP15 with ammonium chloride served as the sole N-source

圖2 地衣芽孢桿菌MP15以亞硝酸鈉作為唯一氮源時的脫氮特性Fig. 2 Nitrogen removal characteristic of B. licheniformis MP15 with sodium nitrite served as the sole N-source

圖3 地衣芽孢桿菌MP15以硝酸鈉作為唯一氮源時的脫氮特性Fig. 3 Nitrogen removal characteristic of B. licheniformis MP15with sodium nitrate served as the sole N-source

2.2 菌株MP15的氨氧化過程抑制

(圖4A為基礎(chǔ)降解液中和TN的濃度變化；圖4B為氧化過程NH2OH的濃度變化。Fig. 4A, Change of and TN concentrations in different culture media; Fig. 4B,Change of concentration of NH2OH during ammonium oxidation.)

2.3 菌株MP15脫氮過程中關(guān)鍵酶活性

對菌株MP15脫氮過程中關(guān)鍵酶活的測定主要包括粗酶液中的硝酸鹽還原酶(Nar)、亞硝酸鹽還原酶(Nir)和羥胺氧化還原酶(Hao)，測定結(jié)果見表1。在菌株MP15脫氮過程中，Nar、Nir和Hao均具有一定量的表達(dá)，在粗酶液中，檢測到菌株MP15的Nar、Nir和Hao的酶比活力分別為0.160 9、0.157 8和0.540 6 U/mg。

表1 地衣芽孢桿菌MP15的脫氮關(guān)鍵酶活性Table 1 Key enzyme activity of B. licheniformis MP15

2.4 15N同位素示蹤測定含氮氣體

表2 地衣芽孢桿菌MP15在不同氮基礎(chǔ)降解液中15N2和15N2O的GC-IRMS檢測結(jié)果Table 2 GC-IRMS results of 15N2 and 15N2O of B. licheniformis MP15

3 討論

綜合菌株M15在不同無機氮基礎(chǔ)降解液中的脫氮特性、脫氮過程中的關(guān)鍵酶活性以及脫氮過程中的15N同位素示蹤，菌株MP15具有高效的同步硝化-反硝化性能，其對無機氮的去除主要包括同化作用、硝化作用和反硝化作用。通過對異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株MP15的脫氮特性和脫氮機制研究，將有助于其在生物脫氮和生物修復(fù)中的實踐應(yīng)用。

4 結(jié)語