趙 勇, 范 春, 朱閩娟, 金 益, 陳國強(qiáng)

(上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心, 上海 201203)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境(barrier environment)是指符合動(dòng)物居住要求，嚴(yán)格控制人員、物品和空氣進(jìn)出，適用于飼育清潔級(jí)(clean animal, CL)和/或無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的系統(tǒng)設(shè)施。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隔離環(huán)境(isolation environment)是指采用無菌隔離裝置以保持無菌狀態(tài)或無外源污染物。隔離裝置內(nèi)的空氣飼料、水、墊科和設(shè)備應(yīng)無菌，動(dòng)物和飼料的動(dòng)態(tài)傳遞須經(jīng)特殊的傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)既能保證環(huán)境的絕對(duì)隔離，又能滿足轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)物時(shí)保持與內(nèi)環(huán)境一致，適用于飼育SPF級(jí)、悉生級(jí)、無菌(germfree)級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[1,2]。本文所指屏障環(huán)境哨兵動(dòng)物設(shè)置技術(shù)也可應(yīng)用于隔離環(huán)境。

屏障系統(tǒng)空氣經(jīng)初效、中效、高效過濾器進(jìn)入屏障系統(tǒng), 潔凈度達(dá)到7級(jí), 一般壓差為20 Pa,沉降菌最大平均濃度(CFU/0.5 h·Φ90 mm平皿)≤3，要求工作人員身體健康，在淋浴后穿戴無菌工作服、口罩、帽子、手套或者穿戴無菌衣、口罩、帽子、手套，風(fēng)淋后進(jìn)入屏障環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的哨兵動(dòng)物一般是指用于監(jiān)控實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中病原及病原感染的動(dòng)物[3]。哨兵動(dòng)物一般來源于與被監(jiān)測(cè)動(dòng)物遺傳學(xué)背景相同、微生物背景明確的動(dòng)物。本技術(shù)所述哨兵動(dòng)物借鑒食品衛(wèi)生哨兵動(dòng)物應(yīng)用范圍，除了作為微生物檢測(cè)所設(shè)置的指示動(dòng)物，同時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水、飼料的安全與營養(yǎng)水平，以及其有害物質(zhì)的污染狀況和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

1 屏障環(huán)境哨兵動(dòng)物設(shè)置總則

一是能夠全面反映整個(gè)屏障系統(tǒng)的環(huán)境狀況。二是設(shè)置的哨兵動(dòng)物是同環(huán)境中在試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替難者，同時(shí)也要注重哨兵動(dòng)物的福利，做到一鼠多檢、一鼠多用，既是微生物監(jiān)測(cè)的指示動(dòng)物同時(shí)也是飼料營養(yǎng)、飲水等的監(jiān)測(cè)動(dòng)物。三是根據(jù)每個(gè)屏障設(shè)施特點(diǎn)設(shè)置哨兵動(dòng)物，遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則的實(shí)踐[4-6]。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哨兵動(dòng)物設(shè)置

2.1 哨兵動(dòng)物遺傳學(xué)分類的設(shè)置選擇

2.1.1 選擇與被監(jiān)測(cè)動(dòng)物一致的品系 每個(gè)品系的動(dòng)物各自都具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，近交系動(dòng)物由于等位基因完全一致，動(dòng)物對(duì)外界的反應(yīng)所呈現(xiàn)的表現(xiàn)型也趨一致, 4周齡ICR小鼠, BALB/c小鼠，C57BL/6小鼠，分別飼喂同種含過期魚粉飼料，與飼喂正常飼料對(duì)照組小鼠產(chǎn)生體質(zhì)量差異(P＜0.05)的時(shí)間分別是9周齡、7周齡和8周齡，并且差異隨周齡延長(zhǎng)而加大，說明不同品系動(dòng)物對(duì)藥物或毒物的耐受有差別。建議選擇與被監(jiān)測(cè)動(dòng)物敏感性一致的動(dòng)物作為哨兵動(dòng)物。由于大鼠、小鼠的品種差異，大鼠、小鼠病毒感染范圍不完全一致，那么同一設(shè)施內(nèi)部大鼠、小鼠都必須分別設(shè)置哨兵動(dòng)物。對(duì)于轉(zhuǎn)基因小鼠, 哨兵動(dòng)物應(yīng)盡量選擇其背景小鼠。

2.1.2 選擇近交系動(dòng)物 雖然非近交品系繁殖性能強(qiáng)，且對(duì)飼料的營養(yǎng)缺乏有一定耐受性，動(dòng)物便宜易得，但封閉群或遠(yuǎn)交系也同時(shí)存在對(duì)病原體和對(duì)某種營養(yǎng)素缺乏，機(jī)體反應(yīng)比近交系動(dòng)物慢的缺點(diǎn), 近交系動(dòng)物相對(duì)非近交動(dòng)物對(duì)疾病易感程度高, 臨床表現(xiàn)型也早。目前轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用廣泛, 轉(zhuǎn)基因小鼠的背景品系小鼠多采用BALB/c和C57BL/6兩種近交系小鼠, 實(shí)驗(yàn)表明，BALB/c小鼠比C57BL/6小鼠對(duì)飼料營養(yǎng)缺乏敏感性更高。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哨兵動(dòng)物微生物學(xué)分類的設(shè)置選擇

2.2.1 選擇SPF動(dòng)物 理論上，選用的哨兵動(dòng)物應(yīng)為無菌動(dòng)物或已知菌動(dòng)物和SPF動(dòng)物，并且要求預(yù)知?jiǎng)游矬w內(nèi)抗體攜帶情況。但實(shí)際應(yīng)用中大都采用SPF級(jí)動(dòng)物。無菌動(dòng)物或已知菌動(dòng)物價(jià)格昂貴，病原體感染死亡率高，故多選用有針對(duì)性的SPF動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。例如小鼠肝炎病毒(MHV)的檢測(cè)是動(dòng)物飼育室比較重要的檢測(cè)項(xiàng)目，運(yùn)用BALB/c 和C57BL/10小鼠感染率和死亡率都很高，但C57BL/10 感染鼠痘病毒(mouse pox)后不出現(xiàn)明顯癥狀[7,8]。

2.2.2 免疫缺陷動(dòng)物的選擇 免疫缺陷動(dòng)物感染病原體后抗體生成率低，尤其是NOD-SCID小鼠、NSG小鼠等重癥免疫缺陷小鼠的血清學(xué)試驗(yàn)常呈陰性，故可能造成假陰性反應(yīng)。裸小鼠等一些免疫缺陷鼠對(duì)飼料的營養(yǎng)及軟硬度的要求均異于其它小鼠，除非有特殊需求，一般不選用裸小鼠作哨兵動(dòng)物，但是考慮到對(duì)病原持續(xù)性感染有利于病原的分離，可選用有毛雜合體小鼠，例如BALB/c (+/nu)[5]。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哨兵動(dòng)物性別及周齡的設(shè)置選擇

2.3.1 哨兵動(dòng)物性別的選擇 有文獻(xiàn)[4]認(rèn)為，選擇哨兵動(dòng)物以雌性動(dòng)物為宜，既可減少動(dòng)物打斗機(jī)率，又可避免意外交配形成的遺傳污染。但雄性BALB/c和C57BL/6的性成熟均晚于雌性動(dòng)物，且不存有4～5 d的性同期，激素水平的波動(dòng)也較雌性為小，雄性動(dòng)物通過快速生長(zhǎng)期到體質(zhì)量平臺(tái)生長(zhǎng)期時(shí)間要比雌性動(dòng)物晚一周左右，所以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物營養(yǎng)監(jiān)測(cè)多采用雄性動(dòng)物。而且目前飼育動(dòng)物的IVC籠也不存在意外交配所形成的遺傳漂變。故可以在飼肓室設(shè)置二雌一雄或單一雄級(jí)哨兵鼠籠盒。

2.3.2 哨兵動(dòng)物周齡選擇 文獻(xiàn)[5,6,9]建議選擇的適齡動(dòng)物通常為3～8周齡，并能較好反映出被監(jiān)測(cè)動(dòng)物健康狀況。但是目前使用的BALB/c雌鼠3周齡時(shí)體質(zhì)量只有14 g左右，且在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育過程中離乳時(shí)間即為4周，建議選擇4周齡以上動(dòng)物作為哨兵動(dòng)物。再則，考慮到對(duì)飼料營養(yǎng)的監(jiān)測(cè)時(shí)的快速生長(zhǎng)周期為4～10周左右，所以哨兵動(dòng)物的周齡選擇為4～6周為宜。

2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哨兵動(dòng)物數(shù)量設(shè)置

2.4.1 哨兵動(dòng)物的檢測(cè)數(shù)量 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哨兵動(dòng)物放置數(shù)量為飼育動(dòng)物數(shù)的千分之一，如為公用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室則哨兵動(dòng)物的數(shù)量要提高1倍, 檢測(cè)動(dòng)物數(shù)量即為放置動(dòng)物數(shù)量, 每籠3只動(dòng)物。以一個(gè)實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)單元(同飼養(yǎng)員, 同實(shí)驗(yàn)人員)管理的SPF級(jí)特定飼養(yǎng)區(qū)50 m2，共4臺(tái)IVC籠位數(shù)為560籠，設(shè)置哨兵動(dòng)物為5只。這相對(duì)于歐洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)聯(lián)盟 (FELASA)推薦的計(jì)算公式[6]。當(dāng)期望檢出陽性率達(dá)30%時(shí)，所需的動(dòng)物數(shù)至少為10只。建議哨兵動(dòng)物放置和檢測(cè)數(shù)量應(yīng)該根據(jù)檢測(cè)頻率變化而有所調(diào)整，當(dāng)連續(xù)3個(gè)檢測(cè)頻次的陽性檢出率均為零時(shí)，也可適當(dāng)減少哨兵動(dòng)物數(shù)量。

2.4.2 哨兵動(dòng)物的檢測(cè)頻率 無論是微生物監(jiān)測(cè)和飼料營養(yǎng)監(jiān)測(cè)，建議都是每月1次。檢測(cè)頻次增加相比檢測(cè)動(dòng)物數(shù)量增加，更可能提高哨兵動(dòng)物使用效率及檢測(cè)陽性率。由于病原的宿主特異性相差甚遠(yuǎn)，有的飼養(yǎng)單元的動(dòng)物品系各異，對(duì)病原的血清學(xué)反應(yīng)也不同，所以每月1次的監(jiān)測(cè)是必要的；同時(shí)考慮到大鼠、小鼠的快速生長(zhǎng)期為3～8周左右，所以在1個(gè)月內(nèi)動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)需求旺盛，故營養(yǎng)檢測(cè)的陽性率也可提高。當(dāng)連續(xù)3個(gè)頻次的陽性檢出率均為零時(shí)，也可適當(dāng)延長(zhǎng)檢測(cè)周期，但是不應(yīng)該少于FELASA 和我國通常使用的檢測(cè)頻率即每季度1次[9,10]。

2.5 哨兵動(dòng)物設(shè)置的位置及接觸方式

2.5.1 哨兵動(dòng)物放置位置 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼育方式有開放平板架飼養(yǎng)，lVC飼養(yǎng)及隔離器飼養(yǎng)等。動(dòng)物室的氣流出口一般設(shè)在飼養(yǎng)室四周角落，那么在開放架飼育環(huán)境中的底層靠近出風(fēng)口處為最佳放置位置。各型號(hào)IVC設(shè)置氣流方式有所不同，但一般在T字型籠位處氣流較強(qiáng)，故哨兵動(dòng)物應(yīng)放置在底層中間位置或正中位置[11]?？梢苑胖眉冉邮芘f墊料又接受廢氣的哨兵動(dòng)物來增加檢出率[12]。在隔離器中飼育的哨兵動(dòng)物，可設(shè)置于出風(fēng)口下方并可采用50% 舊墊料法提高檢出率[13]。如果是對(duì)環(huán)境設(shè)施進(jìn)行微生物監(jiān)測(cè)，那么對(duì)環(huán)境氣流的進(jìn)風(fēng)口也必須設(shè)置哨兵動(dòng)物[14,15]。

2.5.2 哨兵動(dòng)物接觸方式 直接接觸即將哨兵動(dòng)物直接放入到被監(jiān)測(cè)動(dòng)物籠中與被監(jiān)測(cè)動(dòng)物共同飼育2周以上，使哨兵動(dòng)物直接接觸氣溶膠、塵埃粒子及排泄物[9]，此法雖然快捷靈敏，對(duì)接觸傳播病原及營養(yǎng)監(jiān)測(cè)有高效性，但缺陷是監(jiān)測(cè)樣本量少及動(dòng)物間打斗和求偶行為等對(duì)其干擾影響輕大[12]。間接接觸即將被監(jiān)測(cè)的動(dòng)物籠盒中的廢墊料部分或者全部給予哨兵動(dòng)物飼養(yǎng)籠。建議50%臟墊料來源于20籠左右被監(jiān)測(cè)的動(dòng)物，飼養(yǎng)時(shí)間 4周以上[13,14]，同時(shí)應(yīng)用廢氣通入哨兵鼠籠(氨濃度控制在14 mg/m3以下)可以有效增加IVC系統(tǒng)中的微生物監(jiān)測(cè)效率[14]。

無論是直接接觸還是間接觸均不能排除雄性動(dòng)物求偶及其打斗行為發(fā)生，故建議設(shè)置單一雌性動(dòng)物或前述2雌1雄的哨兵動(dòng)物設(shè)置。

2.6 隔離檢疫場(chǎng)所及動(dòng)物運(yùn)輸過程監(jiān)測(cè)設(shè)置

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)出口的檢疫工作除按照《中華人民共和國進(jìn)出口動(dòng)植物檢疫條例》的規(guī)定辦理外，也必須按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》的規(guī)定處理，進(jìn)口大鼠、小鼠要求有14d的檢疫隔離期，隔離期間并未要求有哨兵動(dòng)物參與，但出于對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)所本身生物安全考慮，動(dòng)物到達(dá)的72 h內(nèi)應(yīng)采血樣、皮毛和糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)并在動(dòng)物群中放入接觸式哨兵動(dòng)物，18 d后進(jìn)行檢測(cè)[12]。由于目前進(jìn)口實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢疫期只有14 d，故可在檢疫隔離期滿即對(duì)哨兵動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。并對(duì)通過檢疫入場(chǎng)后動(dòng)物飼育的IVC每層放置哨兵籠盒，用舊墊料法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

運(yùn)輸是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)出口必不可少的環(huán)節(jié), 為使運(yùn)輸過程中的污染風(fēng)險(xiǎn)降低到最小, 應(yīng)用哨兵動(dòng)物對(duì)整個(gè)運(yùn)輸過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)是一個(gè)有效的方法[15]。陸路運(yùn)輸選擇UPS供電的IVC或隔離器比較可靠，同時(shí)長(zhǎng)途運(yùn)輸對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激較大，其中空氣對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量影響最大現(xiàn)有的紙盒包裝不能完全避免污染，所以運(yùn)輸期間安放哨兵動(dòng)物以及在運(yùn)輸工具和隔離場(chǎng)所均可以放置哨兵動(dòng)物21 d以上時(shí)間，每月例檢也同樣重要。進(jìn)口實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和出口實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均建議在其中加入哨兵動(dòng)物共同運(yùn)輸，運(yùn)抵目的地后可進(jìn)行剖檢。目前實(shí)施的14 d檢疫觀察期如不進(jìn)行實(shí)體動(dòng)物剖檢，存在較大污染風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，屏障環(huán)境哨兵動(dòng)物的設(shè)置是保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的主要手段，除根據(jù)環(huán)境設(shè)施的特點(diǎn)選擇哨兵動(dòng)物的種屬、品系、性別、周齡、數(shù)量、接觸方式、放置位置、檢測(cè)頻次外，還應(yīng)考慮哨兵動(dòng)物的抓取應(yīng)激和運(yùn)輸應(yīng)激等人為因素對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果的干擾。

同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 理念，除了哨兵動(dòng)物應(yīng)用于微生學(xué)監(jiān)測(cè)外，充分利用哨兵動(dòng)物對(duì)飼料營養(yǎng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。而不是檢測(cè)哨兵動(dòng)物呈陰性即處死其余同籠哨兵動(dòng)物[11]。提出設(shè)置哨兵動(dòng)物數(shù)即為檢測(cè)動(dòng)物數(shù)。