陳立新 綜述 趙玉婉，柳建軍 審校

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 湛江 524000

腎細(xì)胞癌(RCC)是一種常見的致死性惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的5%，是全球十大最常見癌癥之一。20%～30%的腎細(xì)胞癌患者在被確診后仍有病情局部加重或腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，30%～50%的腎細(xì)胞癌患者在原發(fā)腫瘤切除后病情仍得不到控制[1]。目前，手術(shù)切除是腎細(xì)胞癌患者的主要治療方法，但由于腎細(xì)胞癌患者對化療和放療的抵抗，腎細(xì)胞癌很容易發(fā)展為惡性潛伏期。因此，進(jìn)一步了解腎細(xì)胞癌的具體分子機(jī)制至關(guān)重要。

1 miRNA簡介

自1993 年首次在秀麗隱桿線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)miRNA 后，人們很快意識到其廣泛而重要的作用[2]。microrna(miRNA)是一組內(nèi)源性非編碼功能RNA，長度約為18～25個(gè)核苷酸，廣泛存在于動(dòng)植物中，其生物合成和調(diào)控功能在維持細(xì)胞內(nèi)平衡中具有重要意義。miRNA 是由位于基因間區(qū)和內(nèi)含子基因區(qū)域的DNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來，但也存在于外顯子基因區(qū)域和反義轉(zhuǎn)錄本中[3]。miRNA 從初始加工到最終成熟，均由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，這些RNA聚合酶在5'端生成含有帽狀結(jié)構(gòu)的莖環(huán)初級miRNA(pri-miRNA)，并在3'端發(fā)生聚腺苷酸化[4-6]。然后，在細(xì)胞核中，通過Drosha/DGCR8 復(fù)合物將pri-miRNA 裂解為莖環(huán)前體miRNA(pre-miRNA)，之后，出口蛋白5(XPO5)通過核孔介導(dǎo)易位將pre-miRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，RNase ⅢDicer和TARbinding protein (TRBP)進(jìn)一步處理該分子，轉(zhuǎn)化為包含miRNA-guide 鏈和miRNA-passenger 鏈的雙鏈成熟RNA。它們與Argonaute 一起被整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，以沉默靶向mrna(mRNA)[3，7-8]。單個(gè)mRNA可能被多個(gè)不同的miRNA靶向，其效率各不相同，相反，一個(gè)miRNA可以靶向一個(gè)以上的mRNA。miRNA 通過與靶向mRNA 序列的結(jié)合，具有多種生物學(xué)功能，如抑制或促進(jìn)許多相關(guān)基因表達(dá)的能力，而這些基因可以影響腫瘤發(fā)生發(fā)展所必需的細(xì)胞生物學(xué)功能，如細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡[9-10]。

2 miRNA與腎細(xì)胞癌

微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)證明了miRNA 表達(dá)異常在癌癥中非常常見[11-12]。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，通過基因芯片、實(shí)時(shí)PCR 等高通量技術(shù)，在腫瘤組織和正常組織中可以快速建立miRNA表達(dá)譜，并證實(shí)在大多數(shù)腫瘤中miRNA表達(dá)失調(diào)[13-14]。此外，miRNA在臨床上可應(yīng)用于癌癥管理，不僅在腫瘤診斷，而且可評估惡性腫瘤治療效率，并監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展情況。RCC占所有成人惡性腫瘤的2%～3%，占腎臟原發(fā)性惡性腫瘤的90%，是僅次于前列腺癌和膀胱癌的第三常見泌尿系腫瘤，死亡率極高[15]。腎細(xì)胞癌有多種組織學(xué)亞型，最常見的亞型包括透明細(xì)胞癌(ccRCC)、乳頭狀癌和嫌色性腎細(xì)胞癌。這些亞型加起來約占所有確診腎細(xì)胞癌的90%。腎切除術(shù)是目前腎細(xì)胞癌患者最佳的治療選擇，但20%～40%的患者術(shù)后會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。由于轉(zhuǎn)移性腎癌的預(yù)后情況比較差，而且其對放療、化療均不敏感，臨床上尚無輔助治療，3 年平均存活率低于5%[16]。目前，RCC 的一些預(yù)后因素被應(yīng)用于臨床，包括腫瘤分期、Fuhrman 分級、淋巴結(jié)受累和組織學(xué)亞型。然而，這些因素在預(yù)測疾病方面缺乏準(zhǔn)確性，尤其是在診斷非轉(zhuǎn)移性疾病患者中。RCC的預(yù)后結(jié)果相差很大，現(xiàn)今用于該病早期檢測和隨訪的現(xiàn)有生物標(biāo)志很少，這導(dǎo)致其預(yù)后不良，因此尋找新的可靠的生物學(xué)標(biāo)志物，對腎細(xì)胞癌的早期診斷、治療及預(yù)后有重大意義。

3 miRNA在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)

大量的研究證明，miRNA 可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、分裂、分化、發(fā)育和凋亡等關(guān)鍵過程，進(jìn)而在腎細(xì)胞癌中扮演抑癌基因的角色和癌基因的角色。近年來，人們在發(fā)現(xiàn)新的miRNA、識別miRNA 靶點(diǎn)和破譯miRNA功能方面進(jìn)行了大量的研究[17]。而計(jì)算方法的應(yīng)用有助于闡明miRNA的生物學(xué)作用，因?yàn)樯镄畔W(xué)可以通過建立一種假設(shè)來揭示統(tǒng)計(jì)上顯著的趨勢，然后通過實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。例如，通過對miRNA數(shù)據(jù)集的綜合分析，識別與腫瘤發(fā)展相關(guān)的miRNA[14]，此外，通過整合轉(zhuǎn)錄組分析已證實(shí)腫瘤中miRNA-mRNA的相互作用[18]。而且，通過綜合生物信息學(xué)計(jì)算，可以探索miRNA表達(dá)與基因或通路之間的關(guān)系[19]。例如ZHOU等[20]從腫瘤基因組圖譜(TCGA)中共獲得525 個(gè)透明細(xì)胞RCC (ccRCC) miRNA 表達(dá)譜。將1.5 倍的差異定義為截止水平，在檢測到的1 046個(gè)人類miRNA中，有143 個(gè)miRNA 表達(dá)在RCC 和鄰近正常組織中存在顯著差異，其中62 個(gè)表達(dá)下調(diào)，81 個(gè)表達(dá)上調(diào)，其中miR-124和MEG3顯著下調(diào)。LIANG等[21]通過分析從TCGA 數(shù)據(jù)集中下載的miRNA 測序數(shù)據(jù)，在516 例CCRCC患者中發(fā)現(xiàn)63個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中34個(gè)表達(dá)上調(diào)，29個(gè)表達(dá)下調(diào)。HE等[22]利用微陣列基因芯片技術(shù)觀察到，在9 對ccRCC 樣品中，11 個(gè)miRNA在不同階段普遍失調(diào)，其中3 個(gè)上調(diào)(miR-491-3p、miR-487a和miR-487a)，而與正常組織相比，ccRCC樣本 中 的 miR-125b、miR-142-3p、miR-199a-5p、miR-532-5p、miR-299-3p、miR-29a、miR-429 和miR-22分別下調(diào)。SZABó等[23]發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，在24 個(gè)ccRCC 樣本中miR-21 和miR-221 均顯著升高，而且這些樣本中，上述miRNA 共同表達(dá)高達(dá)79.2%(19 例)，而在正常樣本中只有33.3%(8 例)共同表達(dá)。這提示miR-21 和miR-221 可能都參與了ccRCC的發(fā)生發(fā)展。

4 miRNA在腎細(xì)胞癌中的作用

越來越多的研究表明，miRNA在人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮了巨大的作用。許多miRNA 已經(jīng)在人類基因組中被發(fā)現(xiàn)，其中大多數(shù)在癌細(xì)胞和人類腫瘤中失去了調(diào)控[17，24]。miRNA生物通路的突變和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的解除以及表觀遺傳學(xué)的改變可能單獨(dú)或更有可能共同促進(jìn)miRNA 在腫瘤發(fā)生中的作用[18-19]。最近的一項(xiàng)研究表明，miR-200b 是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)的miRNA[25]。EMT 參與癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的初始步驟，其與上皮特征的缺失和間充質(zhì)標(biāo)志物的獲得有關(guān)，而miR-200b 通過靶向表達(dá)ZEB1 和ZEB2 可以阻止這一過程。LI 等[26]發(fā)現(xiàn)與相鄰的正常組織相比，miR-200b 在臨床RCC 標(biāo)本中的表達(dá)水平明顯較低，此外，miR-200b 的過表達(dá)不僅阻礙了Caki-1 和OSRC-2 細(xì)胞的增殖和遷移，還抑制了患者來源的異種移植物和細(xì)胞來源的異種移植物在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。另一項(xiàng)研究表明，轉(zhuǎn)移瘤抗原-1(MTA-1)作為人類腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)，通過抑制E-cadherin(上皮細(xì)胞鈣黏蛋白)轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程[27]。YANG 等[28]則發(fā)現(xiàn)miR-30c 可降低Caki-1 細(xì)胞中MTA-1 的表達(dá)，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移。這提示miR-30c 可能參與下調(diào)MTA-1，抑制ccRCC 的發(fā)展。WANG 等[29]研究表明，在A498和786O細(xì)胞系中上調(diào)miR-30e-3p，通過直接靶向其3'-UTR，可以明顯降低Snail1的表達(dá)，顯著增強(qiáng)ccRCC細(xì)胞的侵襲和遷移。轉(zhuǎn)染缺乏3'-UTR的A498和786O 細(xì)胞，其增強(qiáng)了Snail1 的表達(dá)，與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，miR-30e-3p抑制了ccRCC細(xì)胞的侵襲和遷移，這些結(jié)果表明，miR-30e-3p 通過直接抑制Snail1而增強(qiáng)了ccRCC細(xì)胞的侵襲和遷移能力。而有人利用TargetScan 工具，發(fā)現(xiàn)RAB23 是miR-384 的一個(gè)潛在靶基因，其是GTPases Rab 家族成員，是Sonic hedgehog基因信號通路的負(fù)調(diào)控因子，在癌癥的發(fā)展中起著重要的作用；與非腫瘤組織相比，RCC 組織中RAB23表達(dá)上調(diào)，35例患者中22例(22/35，62%)RCC組織中RAB23 表達(dá)較高，證明了在RCC 組織中miR-384的低表達(dá)與RAB23的高表達(dá)有關(guān)，即RAB23的過表達(dá)促進(jìn)了RCC細(xì)胞的增殖、遷移[30]。HE等[31]則通過生物信息學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)HOXA3 mRNA 是miR-10b的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的miR-10b 抑制HOXA3 的表達(dá)，而miR-10b 的缺失顯著增強(qiáng)了HOXA3 的表達(dá)。此外，在ccRCC 細(xì)胞中敲低YAP 可明顯減少HOXA3 表達(dá)而敲低FAK 可同時(shí)降低YAP 和HOXA3 表達(dá)。顯然，這證明了miR-10b通過靶向ccRCC 中FAK/ YAP 信號通路調(diào)控的HOXA3 抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。miR-218 在ccRCC組織中的表達(dá)水平低于相鄰非腫瘤組織，其低表達(dá)與更具侵襲性的腫瘤表型特征(包括更大的腫瘤和更高的腫瘤分期)顯著相關(guān)，而在功能檢測中，miR-218 過表達(dá)顯著抑制癌細(xì)胞增殖和遷移。

5 預(yù)后生物標(biāo)志物

RCC患者的預(yù)后差異很大，早期發(fā)現(xiàn)有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者可以改善患者預(yù)后。目前臨床上尚不能可靠地預(yù)測該疾病，因此確定新的生物標(biāo)志物，可以幫助預(yù)測患者病情并改善預(yù)后。XIE等[32]從UCSC Xena下載臨床信息和癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫中ccRCC 的miRNA 表達(dá)譜，采用limma 包分析ccRCC 與正常組織中表達(dá)差異的miRNA，根據(jù)預(yù)后指數(shù)(PI)公式建立多變量Cox 回歸模型，按中位PI 將ccRCC 患者分為低危組和高危組。利用miRNet 進(jìn)行靶基因預(yù)測和功能富集分析，確定了miRNA-21-5p、miRNA-9-5p、miR-149-5p 和miRNA 30b-5p 作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)并使用這4 個(gè)miRNA 為每個(gè)患者構(gòu)建一個(gè)4-miRNA PI。發(fā)現(xiàn)高危組(n=119)患者的生存時(shí)間明顯短于低危組(n=118)(高危/低危組log-rank P=0.000)。與常規(guī)臨床病理特征相比，4-miRNA是一個(gè)獨(dú)立且全面的預(yù)后因素，其靶基因參與了與癌癥相關(guān)的各種通路，如MAPK、p53、Wnt 信號通路。因此4-miRNA 信號與ccRCC患者的生存相關(guān)，可以作為ccRCC預(yù)后的生物標(biāo)志物[32]。CARLSSON等[33]利用RT-qPCR檢測116例ccRCC患者腎組織中miR-126、miR-21和miR-10b的表達(dá)。三種miRNA 在惡性組織和良性組織中均有差異表達(dá)，與良性組織相比，惡性組織中miR-126 (P=0.004)和miR-21(P＜0.001)上調(diào)，miR-10b(P＜0.001)下調(diào)。此外，miR-126 和miR-10b 在ccRCC 的分級和分期中也有差異表達(dá)。在單變量而非多變量模型中，miR-126的低表達(dá)與較短的復(fù)發(fā)時(shí)間有關(guān),在研究的3個(gè)miRNA中，miR-126的表達(dá)最有可能作為ccRCC患者的預(yù)后標(biāo)志物。QUAN 等[34]發(fā)現(xiàn)miR-23a-3p 在RCC 組織、RCC 細(xì)胞系中顯著上調(diào)，通過上調(diào)miR-23a-3p 可增強(qiáng)細(xì)胞活力，而沉默miR-23a-3p 可抑制ACHN和786-O細(xì)胞系的細(xì)胞活力、增殖和遷移；進(jìn)行cox 比例危險(xiǎn)回歸分析表明，低表達(dá)miR-23a-3p患者總體生存期顯著延長。此外，通過FFPE 腎細(xì)胞癌樣本分析miR-23a-3p 表達(dá)與患者總體生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-23a-3p表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分期無顯著相關(guān)性，然而，miR-23a-3p過表達(dá)與晚期腫瘤有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著相關(guān)，即miR-23a-3p高表達(dá)的患者總體生存期顯著縮短，故miR-23a-3p可能是RCC診斷、疾病監(jiān)測和預(yù)后的一個(gè)可靠的生物標(biāo)志物。LI 等[35]研究發(fā)現(xiàn)miR-31-5p 在786-0 和ACHN細(xì)胞周期的G2/M 期引起細(xì)胞周期阻滯。此外，在42份FFPE 腎細(xì)胞癌樣本中，miR-31-5p 表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤大小或腫瘤分期無關(guān)，但miR-31-5p低表達(dá)與總體生存期低明顯相關(guān)。Cox 比例危險(xiǎn)回歸分析進(jìn)一步說明，在單因素和多因素分析中，miR-31-5p 低表達(dá)的患者生存時(shí)間更短(P＜0.05)，這為miR-31-5p 作為ccRCC 患者的預(yù)后標(biāo)志物提供了理論基礎(chǔ)。

6 治療

近年來，很多研究闡明了miRNA 在RCC 中的作用規(guī)律，其不僅是檢測預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，也是一種很有前景的治療方法，而且研究表明miRNA相關(guān)治療可能提高經(jīng)典化療的療效。例如，研究發(fā)現(xiàn)，與對舒尼替尼治療敏感者相比，對舒尼替尼治療抵抗的ccRCC 患者miR-141 明顯下調(diào)。舒尼替尼抗ccRCC的作用機(jī)制是通過抑制血管生成，誘導(dǎo)缺氧導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而在UMRC-2 和RCC4 細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-141過表達(dá)主要源于缺氧環(huán)境，增加了對舒尼替尼的敏感性[36-37]。另外，YANG等[38]研究發(fā)現(xiàn)，miR-30c感染Caki-1細(xì)胞后，紫杉醇和索拉非尼明顯抑制Caki-1細(xì)胞的存活和菌落形成能力。ZHONG等[1]利用生物信息學(xué)方法，證實(shí)HMGB1 為miR-505 的直接下游靶基因，且通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)，并發(fā)現(xiàn)HMGB1 在腎癌組織中明顯過表達(dá)，與腎癌患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。此外，體外敲除RCC細(xì)胞系中的HMGB1 可抑制腫瘤生長，為以HMGB1 為靶點(diǎn)對RCC進(jìn)行再灌注治療提供了新的理論依據(jù)[39]。

7 結(jié)語

miRNA 作為一種小分子的核苷酸非編碼RNA，是細(xì)胞增殖、分裂、分化和凋亡等過程的重要調(diào)控因子；它們參與了RCC 的多種生物學(xué)和病理過程。本文綜述了miRNA 的表達(dá)譜、生物學(xué)功能及其在RCC發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。大量的研究結(jié)果表明，miRNA 作為預(yù)測生物標(biāo)志物和包括RCC 在內(nèi)的不同腫瘤類型的新治療方法正在出現(xiàn)。深入研究miRNA 調(diào)控RCC 發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制，對RCC的早期診斷、預(yù)后檢測及治療有重大的意義。但盡管近年來進(jìn)展顯著，對RCC 與miRNA 之間的關(guān)系仍不完全了解，miRNA 治療應(yīng)用仍存在一些問題，如靶向性差、安全性低等，因此，需要進(jìn)一步研究及明確miRNA 在RCC 中的具體調(diào)控機(jī)制，為尋找新的miRNA 相關(guān)藥物和特異性更高的藥物提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。相信隨著科學(xué)技術(shù)及研究的發(fā)展，miRNA 在RCC 中的功能和具體作用機(jī)制會(huì)進(jìn)一步明確，miRNA 在RCC 的早期診斷、預(yù)后檢測及治療等方面將發(fā)揮更大的作用。