曠達(dá)彬 董李晨 李逃明 楊中保 左美玲

心血管疾?。–VD）是當(dāng)前人類發(fā)病和死亡的主要原因。非對(duì)稱二甲基精氨酸（ADMA）是人體內(nèi)一氧化氮合酶（NOS）的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其能降低一氧化氮（NO）的生物利用度并且可以增加NO 衍生的活性氧的產(chǎn)生。血漿ADMA 水平是CVD 患者預(yù)后及死亡率最強(qiáng)且獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素之一。二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶-1（DDAH1）為ADMA 的主要代謝酶，介導(dǎo)ADMA 的代謝滅活。DDAH1 在維持體內(nèi)NO 水平和保護(hù)心血管功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在這里，我們將對(duì)DDAH1 介導(dǎo)CVD 發(fā)生發(fā)展及治療的最新研究進(jìn)行綜述。

1 DDAH1 為ADMA 主要代謝酶

早在數(shù)十年前就有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，ADMA 可通過與L-精氨酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合NOS，減少NO 的生成[1]，同時(shí)還可以促進(jìn)超氧化物的形成。而隨著研究技術(shù)的不斷更新，目前大量的臨床及基礎(chǔ)研究均已表明，ADMA 與CVD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后密切相關(guān)。ADMA 被公認(rèn)為是各種心血管疾?。ɡ绺哐獕?，冠狀動(dòng)脈疾病，動(dòng)脈粥樣硬化，肺動(dòng)脈高壓，心房纖顫，中風(fēng)，外周血管疾病，糖尿?。┑膹?qiáng)而獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[2]。

人體內(nèi)高達(dá)80%的ADMA 主要通過二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶（DDAH）水解，其余部分經(jīng)尿排泄[3]。DDAH 具有DDAH1 和DDAH2 兩種亞型。早期關(guān)于細(xì)胞及組織器官特異性DDAH 生物學(xué)調(diào)控NO 產(chǎn)生的功能的研究發(fā)現(xiàn)，DDAH1 在心臟、血管和血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)極少[4]，因此，多年來人們一直認(rèn)為DDAH2 在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)中的ADMA 降解中起主要作用。但是，最近的研究清楚地表明，DDAH1 在ADMA 的降解中起著重要作用，而DDAH2 在ADMA 代謝中并未檢測(cè)到明顯作用。研究發(fā)現(xiàn)，全身性DDAH1 敲除小鼠DDAH 酶活性完全消除，但其體內(nèi)DDAH2 的表達(dá)并不受影響[5]。換言之，即使DDAH2 的表達(dá)在這些組織中保持正常水平，全敲除DDAH1 小鼠體內(nèi)任一組織均無法降解ADMA。與之相一致的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，雜合型DDAH1 敲除小鼠的組織DDAH 活性降低了約50%，而通過檢測(cè)DDAH1 表達(dá)發(fā)現(xiàn)其降低了50%[6]。此外，選擇性敲除內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的DDAH1，能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞中ADMA 的蓄積，降低培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞中NO 的產(chǎn)生[5]。過表達(dá)DDAH1 可降低培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞中的ADMA 水平[7]。這些結(jié)果從體內(nèi)體外，動(dòng)物及人類細(xì)胞多方面證實(shí)，DDAH1 為ADMA降解的關(guān)鍵酶，而DDAH2 在小鼠和人類細(xì)胞的ADMA 降解過程中的作用不明顯。

2 DDAH1 在CVD 發(fā)生發(fā)展中的作用

由于DDAH1 為人體內(nèi)代謝ADMA 的關(guān)鍵酶，DDAH1 水平的下降及其活性的降低可導(dǎo)致血漿和組織ADMA 和L-NMMA 水平增加，引起NO 產(chǎn)生的減少，從而導(dǎo)致血壓升高和內(nèi)皮功能紊亂[5]。2015年的研究已發(fā)現(xiàn)，DDAH1 在一系列血管和非血管細(xì)胞中廣泛表達(dá)并維持內(nèi)皮功能。研究者使用基質(zhì)膠培養(yǎng)主動(dòng)脈環(huán)以探索離體內(nèi)皮特異性DDAH1 敲除小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生能力發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞DDAH1 的缺失可嚴(yán)重影響內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力，而外源性L-精氨酸可逆轉(zhuǎn)這一作用。同時(shí)作者還發(fā)現(xiàn)，對(duì)內(nèi)皮特異性DDAH1 敲除小鼠進(jìn)行股動(dòng)脈結(jié)扎后，其后肢缺血誘導(dǎo)的血管生長(zhǎng)速率明顯降低，血管損傷修復(fù)受到抑制[8]。Zhang等[9]通過在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的過表達(dá)或沉默DDAH1 發(fā)現(xiàn)，DDAH1 通過誘導(dǎo)Akt 磷酸化以及介導(dǎo)ADMA 代謝的途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和小管形成。隨后，該研究通過構(gòu)建小鼠頸動(dòng)脈損傷模型，研究?jī)?nèi)皮剝離后的再生情況，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，DDAH1 內(nèi)皮特異性敲除小鼠內(nèi)皮再生功能受損[7]。與之相對(duì)應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，左股動(dòng)脈損傷小鼠模型中，hDDAH1 轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比，其內(nèi)皮細(xì)胞再生和新內(nèi)膜形成能力顯著增強(qiáng)[10]。上述研究表明，上調(diào)DDAH1 的表達(dá)或活性可用于恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能進(jìn)而發(fā)揮治療CVD 的作用。

除內(nèi)皮功能紊亂外，在CVD 的進(jìn)程中，血脂異常、血糖水平升高以及動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生均起著關(guān)鍵作用[11]。DDAH1 能夠通過調(diào)控這些因素，從而影響CVD 的進(jìn)程。研究表明，在給小鼠注射大劑量的葡萄糖（HG）后，野生型小鼠體內(nèi)ADMA濃度迅速上升，而過表達(dá)DDAH1 小鼠無此現(xiàn)象。此外，DDAH1 轉(zhuǎn)基因小鼠注射HG 后均無血漿胰島素和葡萄糖水平急速增加的現(xiàn)象，其胰島素拮抗系數(shù)較野生型降低50%，與胰島素敏感性增強(qiáng)相一致[12]。最近的一項(xiàng)研究顯示，DDAH1 能夠保護(hù)小鼠高脂肪飲食（HFD）誘導(dǎo)發(fā)生的脂肪肝和胰島素拮抗。在HFD 喂養(yǎng)的小鼠肝臟中，DDAH1 敲除小鼠較野生型的肝臟脂肪增加[13]。同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)，DDAH1 轉(zhuǎn)基因小鼠其內(nèi)皮功能在HFD 喂養(yǎng)的條件下較野生型得到改善，過表達(dá)DDAH1 還可減緩HFD 誘導(dǎo)AS 進(jìn)程[14]。這些研究結(jié)果證實(shí)，DDAH1 不但參與了維持體內(nèi)內(nèi)皮功能的穩(wěn)定，同時(shí)對(duì)血糖、血脂這些CVD 的關(guān)鍵影響因素有著重要調(diào)控作用，能夠從多方面維持體內(nèi)心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。

3 DDAH1 在心血管疾病進(jìn)程中的表達(dá)調(diào)節(jié)及機(jī)制

在體內(nèi)DDAH1 的表達(dá)受多種因素調(diào)控，內(nèi)源性的ADMA 主要由精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶1（PRMT1）催化合成。研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)條件下，左心室（LV）壁中DDAH1 表達(dá)不均勻，其在心外膜中表達(dá)最高。當(dāng)出現(xiàn)局部缺血性刺激時(shí)，缺血區(qū)心肌組織中DDAH1 表達(dá)上調(diào)，這一改變與心肌間質(zhì)液（MIF）中ADMA 的下降有關(guān)，并可能是通過PRMT1 途徑進(jìn)行調(diào)控[15]。這一結(jié)果證實(shí)，DDAH1 作為體內(nèi)主要降解ADMA 的酶的同時(shí)，其表達(dá)水平受ADMA 反饋調(diào)節(jié)。

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，DDAH1 的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）中的含有miR-21 識(shí)別元件（MRE），DDAH1為miR-21 的靶基因。在培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞中，內(nèi)源性活性醛4-羥基壬烯醛（4-HNE）可通過miR-21 依賴的機(jī)制下調(diào)DDAH1 的表達(dá)[16]。之后，這一發(fā)現(xiàn)被Iannone 等[17]所證實(shí)。他們的研究證實(shí)，miR-21 介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙中，DDAH1內(nèi)皮特異性表達(dá)下調(diào)，miR- 21/DDAH1/ADMA 通路介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓（PAH）的發(fā)生發(fā)展。而最近的一篇研究中，Zhao 等[18]發(fā)現(xiàn)在永生化的DDAH1 敲除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）中，miR-21 表達(dá)上調(diào)4 倍，其機(jī)制依賴氧化應(yīng)激通路和NF-κB 激活。在細(xì)胞氧化還原狀態(tài)和凋亡調(diào)控中，DDAH1 通過DDAH1-miR-21 通路發(fā)揮其非酶功能。同時(shí)miR-21 又能反過來調(diào)控DDAH1 的表達(dá)，二者之間存在反饋調(diào)控環(huán)路。這些研究揭示了miR-21/DDAH1/ADMA 相互調(diào)控機(jī)制在CVD 發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。

在2013年，通過對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH1-V2 表達(dá)進(jìn)行研究，Sun 等[19]發(fā)現(xiàn)了DDAH1 的一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本，并將其命名為DDAH1-V3。DDAH1-V1與-V2/V3 轉(zhuǎn)錄本具有不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，但其共享3'-UTR 區(qū)；在培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞中僅DDAH1-V1 表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)ADMA 代謝活性相關(guān)，提示DDAH1-V2/V3 不參與ADMA 代謝[19]。在后續(xù)的研究中，其通過機(jī)制實(shí)驗(yàn)探究了DDAH1-V2和DDAH1-V3 潛在的功能，研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞中，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的mRNA 表達(dá)之間呈正相關(guān)[19]；而在急性缺血性卒中（AIS）和急性心肌梗死（AMI）患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中，DDAH1-V1 和DDAH1-V2 的表達(dá)之間的相關(guān)性增加而DDAH1-V2 和DDAH1-V3 之間的相關(guān)程度下降[19]；miR-21 抑制劑對(duì)DDAH1-V3 的上調(diào)程度最高，DDAH1-V3 可能作為miRNA 海綿介導(dǎo)miR-21對(duì)DDAH1 表達(dá)的調(diào)控[20]。

4 以DDAH1 為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)現(xiàn)狀

從新藥研發(fā)角度來看，針對(duì)DDAH1/ADMA 研究主要集中在兩個(gè)方面：一方面通過調(diào)控DNA 轉(zhuǎn)錄水平，影響基因啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子（TF）的結(jié)合，進(jìn)而影響DDAH1 mRNA 的表達(dá)，從而進(jìn)一步影響其蛋白的表達(dá)。DDAH1 的基因啟動(dòng)子區(qū)域含有NF-κB 等多個(gè)TF 結(jié)合位點(diǎn)[18]，然而目前針對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的藥物研發(fā)不多見。有研究報(bào)道，QTsome 新型脂質(zhì)納米顆粒制劑基于季胺和叔胺陽離子脂質(zhì)的組合，快速投遞AM-21（AntimiR-21），以對(duì)抗miR-21 對(duì) DDAH1 mRNA 轉(zhuǎn)錄抑制作用，上調(diào)DDAH1 水平[21]。DDAH1 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控作為藥物靶點(diǎn)的藥物開發(fā)還有待進(jìn)一步繼續(xù)研究。另一方面是對(duì)DDAH1 翻譯后水平的調(diào)節(jié)，即對(duì)DDAH1 催化位點(diǎn)的活性進(jìn)行修飾。常見的翻譯后修飾主要是氨基酸殘基的抗氧化作用，避免DDAH1 活性催化位點(diǎn)區(qū)域含巰基的半胱氨酸殘基氧化失活。有研究指出，抗氧化劑普羅布考可提升內(nèi)皮細(xì)胞DDAH的活性，上調(diào)內(nèi)皮一氧化氮合成酶的表達(dá)，進(jìn)而顯著降低細(xì)胞內(nèi)ADMA 的水平[22]。在HFD 誘導(dǎo)的胰島素拮抗動(dòng)物模型中，具有降血脂功能的內(nèi)皮保護(hù)藥阿托伐他?。╝torvastatin）可逆轉(zhuǎn)胰島素拮抗導(dǎo)致的DDAH1 酶活性降低和表達(dá)下調(diào)，通過DDAH1 介導(dǎo)其內(nèi)皮保護(hù)作用[23]。此外，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥湯劑血府逐瘀湯可增加C57BL/6 小鼠體內(nèi)DDAH1 的表達(dá)，降低C57BL/6 小鼠體內(nèi)ADMA 的水平，進(jìn)而減少纖維化小鼠肝臟的炎癥和纖維化進(jìn)程[24]。最新的一篇研究證實(shí)，藤茶提取物二氫楊梅素（DMY）能夠通過miR-21/DDAH1/ADMA/NO 途徑發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用[2]。這些結(jié)果提示，從現(xiàn)有的化學(xué)藥物、中藥飲片或中藥單體中開發(fā)DDAH1 通路介導(dǎo)的心血管保護(hù)作用藥物具有重大發(fā)展前景。

5 展望

目前DDAH1 與心血管疾病之間相互關(guān)系的研究狀況表明，DDAH1 的表達(dá)及活性的改變?cè)谛难芗膊〉倪M(jìn)展中起重要作用，同時(shí)心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素血脂、血糖和炎癥因子等又能反饋性地調(diào)控DDAH1 的水平。轉(zhuǎn)錄因子、miRNA 以及DDAH1自身海綿機(jī)制能夠通過與DDAH1 的交互作用影響DDAH1 表達(dá)及活性進(jìn)而影響疾病發(fā)病及進(jìn)展。關(guān)于DDAH1 靶向藥物的研發(fā)進(jìn)展使得研究人員和臨床醫(yī)生對(duì)于DDAH1 的關(guān)注不僅局限于最初、探討其作為心血管疾病預(yù)后預(yù)測(cè)Biomarker 的功能，更重要的是其潛在發(fā)展成為心血管疾病針對(duì)性治療藥物研發(fā)的新方向。