不同巴氏殺菌條件下的牛源乳鐵蛋白對IEC-6細(xì)胞增殖的影響

席恩澤，趙 曉，崔東影，盛 雪，李夢寒，許曉曦

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

嬰兒出生時(shí)腸道發(fā)育尚未成熟，腸道免疫發(fā)育緩慢[1]，這使得他們更容易發(fā)生各種并發(fā)癥，包括乳糖不耐受、產(chǎn)后生長受限、感染和壞死性小腸結(jié)腸炎等。母乳含有許多生物活性成分，有助于嬰兒腸道生長和發(fā)育，其中重要的一種組分就是乳鐵蛋白[2]。乳鐵蛋白屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，是一種分子質(zhì)量為78 kDa的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，含有約690 個(gè)氨基酸殘基[3]。除了促進(jìn)腸道細(xì)胞生長和發(fā)育外，乳鐵蛋白還具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎、抗寄生蟲、抗過敏和抗癌特性[4-5]。因此，關(guān)于乳鐵蛋白調(diào)節(jié)腸道免疫功能的研究近年來受到了學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前，乳鐵蛋白已成為嬰兒配方奶粉的主要功能性添加成分，而針對牛源乳鐵蛋白對嬰兒腸道及免疫的影響尚鮮有探究。迄今為止，母乳喂養(yǎng)是保留乳中免疫蛋白生物活性的最佳方法。但由于各種原因，仍有至少一半的新生兒及嬰兒無法通過母乳喂養(yǎng)獲得相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)及免疫功能，需要通過配方奶粉及配方乳替代母乳。傳統(tǒng)的配方奶粉及配方乳為了保證產(chǎn)品的安全性必須進(jìn)行較高溫度的熱處理，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、維生素?fù)p失等問題，并會(huì)產(chǎn)生一些美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。此外，熱處理會(huì)誘導(dǎo)乳蛋白的變性和聚集，從而改變其生物活性和結(jié)構(gòu)特性[6]。乳鐵蛋白具有熱敏性，其鐵結(jié)合能力高度依賴于獨(dú)特結(jié)構(gòu)，熱處理可能對其免疫活性產(chǎn)生影響。

熱處理對乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)、鐵結(jié)合能力[7]、抑菌功能[8]、促成骨細(xì)胞增殖和分化功能[9]的影響是目前研究的熱點(diǎn)。但至今對巴氏殺菌后乳鐵蛋白影響腸道免疫的機(jī)制，特別是腸細(xì)胞增殖方面的探討仍鮮見報(bào)道。因此，本研究旨在探討乳鐵蛋白在常見巴氏殺菌條件下被嬰兒胃腸液進(jìn)一步水解后的免疫功能，并進(jìn)一步探究乳鐵蛋白對腸道免疫的作用機(jī)制。以期為乳鐵蛋白作為營養(yǎng)添加劑在嬰兒配方食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛鮮乳來源乳鐵蛋白 美國Hilmar公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 北京索萊寶生物技術(shù)公司；大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞（IEC-6） NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心；DMEM培養(yǎng)基和胰酶 美國Gibco公司；胎牛血清加拿大MULTICELL公司；磷酸鹽緩沖液 北京BioTopped公司；CCK-8試劑盒 南京建成生物工程研究所；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、雙抗 上海碧云天生物技術(shù)公司；培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTMKit 大連寶生物工程有限公司；引物 上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HF90型CO2培養(yǎng)箱 北京市六一儀器廠；AE-31型倒置顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；BPG-9070A鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；MHBS-1096A酶標(biāo)儀 南京DeTie公司；BSA224S分析天平 德國Sartorius公司；DSX-280B高壓滅菌鍋 上海申安公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；FACSAria流式細(xì)胞儀 美國BD公司；Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國賽默飛世爾公司。

1.3 方法

1.3.1 乳鐵蛋白加熱處理及實(shí)驗(yàn)分組

準(zhǔn)確稱取1 g牛源乳鐵蛋白，溶于10 mL超純水中，置于鋁盒中水浴加熱，加熱條件分別為63 ℃、30 min，72 ℃、15 s和85 ℃、15 s。實(shí)驗(yàn)分為5 組，分別為空白組、未熱處理組、63 ℃/30 min組、72 ℃/15 s組和85 ℃/15 s組?？瞻捉M為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，未熱處理組為添加不經(jīng)過熱處理的乳鐵蛋白水解液。

1.3.2 體外模擬嬰兒胃腸道消化

按照文獻(xiàn)[10]所述方法模擬消化環(huán)境，并稍作改動(dòng)。模擬胃液：用1 mol/L鹽酸調(diào)至pH 4，加入蒸餾水定容至100 mL，加入0.8 g胃蛋白酶，然后將1.3.1節(jié)中的乳鐵蛋白液加入模擬胃液。保持37 ℃，在搖床中振蕩孵育1.5 h。模擬腸液：將上述模擬胃液用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH 6.5，加入6.8 g K2HPO4、1 g膽鹽[11]和1 g胰蛋白酶，繼續(xù)37 ℃恒溫振蕩孵育2 h，85 ℃水浴加熱5 min使酶滅活[12]。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 不同條件巴氏殺菌后的乳鐵蛋白水解液對IEC-6細(xì)胞增殖的影響

將未熱處理組和3 種熱處理組的乳鐵蛋白水解液溶于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，配制不同質(zhì)量濃度的乳鐵蛋白水解液刺激IEC-6細(xì)胞。將1.3.3節(jié)所培養(yǎng)的細(xì)胞調(diào)至1×104個(gè)/mL，每孔100 μL接種到96 孔培養(yǎng)板中，饑餓處理24 h后，分別添加不同質(zhì)量濃度的乳鐵蛋白水解液，培養(yǎng)24、48 h后吸除培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% CCK-8的1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長處振蕩60 s測定OD值，比較各組OD值以判斷4 種處理方式的乳鐵蛋白水解液（未熱處理、63 ℃/30 min、72 ℃/15 s和85 ℃/15 s組）作用于細(xì)胞的最佳質(zhì)量濃度。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式如下。

1.3.5 不同條件巴氏殺菌后的乳鐵蛋白水解液對IEC-6細(xì)胞周期的影響

將1.3.3節(jié)所培養(yǎng)細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，饑餓處理，當(dāng)細(xì)胞融合至70%后，加入最佳質(zhì)量濃度的乳鐵蛋白水解液，分別培養(yǎng)24、48 h后，按照細(xì)胞周期試劑盒說明書進(jìn)行操作，將所收集的細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，并采用ModFit LT軟件進(jìn)行分析。

1.3.6 不同條件巴氏殺菌后的乳鐵蛋白水解液對IEC-6細(xì)胞凋亡的影響

將1.3.3節(jié)所培養(yǎng)的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，饑餓處理，當(dāng)細(xì)胞融合至70%后加入最佳質(zhì)量濃度的乳鐵蛋白水解液，分別培養(yǎng)24、48 h后，按照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，將所收集的細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.7 不同條件巴氏殺菌后的乳鐵蛋白水解液對細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

將1.3.3節(jié)所培養(yǎng)的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞濃度為4×106個(gè)/mL，饑餓處理，當(dāng)細(xì)胞融合至80%后，加入最佳質(zhì)量濃度的乳鐵蛋白水解液進(jìn)行培養(yǎng)，并按照試劑盒步驟提取細(xì)胞RNA、反轉(zhuǎn)錄cDNA、添加引物。采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序，擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40 次。結(jié)果采用儀器自帶軟件進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt法計(jì)算[13]。PCR引物如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)均使用Statistix 8軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Origin 8.5軟件作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對IEC-6細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)初期質(zhì)量濃度選定范圍為0～1 mg/mL中幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示細(xì)胞增殖率以0.1 mg/mL為分界線，當(dāng)質(zhì)量濃度小于0.1 mg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率逐漸增大；當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.1 mg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)降低趨勢。最終選定最佳質(zhì)量濃度范圍為0～0.1 mg/mL內(nèi)幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)質(zhì)量濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算分別培養(yǎng)24、48 h時(shí)的細(xì)胞增殖率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 巴氏殺菌后乳鐵蛋白水解液對IEC-6細(xì)胞增殖的影響Fig. 1 Effect of lactoferrin hydrolysates on the proliferation of IEC-6 cells

如圖1所示，隨著乳鐵蛋白水解液質(zhì)量濃度的升高，IEC-6細(xì)胞增殖率逐漸升高，且呈劑量依賴，在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率達(dá)到最大；當(dāng)質(zhì)量濃度在0.1 mg/mL以上時(shí)細(xì)胞增殖率開始呈現(xiàn)下降趨勢。綜合24 h和48 h細(xì)胞增殖率數(shù)據(jù)來看，與未熱處理的牛源乳鐵蛋白水解液相比，除了63 ℃/30 min組，其他2 種熱處理方式對乳鐵蛋白的免疫活性沒有明顯的破壞作用，加熱并沒有使乳鐵蛋白的免疫活性基團(tuán)完全失活，4 種處理方式下的乳鐵蛋白水解液最佳增殖質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL。

2.2 巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對IEC-6細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期進(jìn)程涉及G0期、G1期、S期、G2期和M期。在G0期時(shí)細(xì)胞靜止、停止分裂。在G1期時(shí)，細(xì)胞的大小、體積增加，并準(zhǔn)備在S期發(fā)生細(xì)胞DNA合成與復(fù)制。G2期是DNA合成和有絲分裂之間的間隙，確保細(xì)胞準(zhǔn)備就緒。進(jìn)入M階段時(shí)細(xì)胞有序地分裂成兩個(gè)子細(xì)胞[14]。

細(xì)胞周期分布比例通常被認(rèn)為是細(xì)胞存活、生長和增殖的主要參數(shù)。為探究3 種巴氏殺菌處理方式下牛源乳鐵蛋白水解液對腸細(xì)胞增殖的機(jī)制，采用質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的牛源乳鐵蛋白水解物分別作用于IEC-6細(xì)胞24、48 h后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析其對細(xì)胞周期的影響及各周期所占比例。

表2 0.1 mg/mL乳鐵蛋白水解液作用24 h對IEC-6細(xì)胞周期的影響Table 2 Effect of 0.1 mg/mL lactoferrin hydrolysates on cell cycle of IEC-6 cells incubated for 24 h

表3 0.1 mg/mL乳鐵蛋白水解液作用48 h對IEC-6細(xì)胞周期的影響Table 3 Effect of 0.1 mg/mL lactoferrin hydrolysates on cell cycle of IEC-6 cells incubated for 48 h

如表2、3所示，用63 ℃、30 min，72 ℃、15 s和85 ℃、15 s熱處理?xiàng)l件下的乳鐵蛋白水解液處理IEC-6細(xì)胞24 h后，與空白組相比，G0/G1期分布比例由85.84%分別降至61.44%、71.28%、67.80%和63.80%；處理48 h后分別從85.11%下降到61.64%、74.61%、73.58%和69.97%，且差異顯著（P＜0.05）。表明牛源乳鐵蛋白通過降低細(xì)胞G0/G1期比例來促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖。與未熱處理的乳鐵蛋白水解液相比，除85 ℃/15 s組外，其余2 種熱處理方法均顯著降低IEC-6細(xì)胞在G2/M+S期的比例（P＜0.05），表明85 ℃、15 s對乳鐵蛋白的免疫活性基團(tuán)無明顯破壞。

2.3 巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對IEC-6細(xì)胞凋亡的影響

表4 0.1 mg/mL乳鐵蛋白水解液作用24 h對IEC-6細(xì)胞凋亡的影響Table 4 Effect of 0.1 mg/mL lactoferrin hydrolysates on cell apoptosis of IEC-6 cells incubated for 24 h

表5 0.1 mg/mL乳鐵蛋白水解液作用48 h對IEC-6細(xì)胞凋亡的影響Table 5 Effect of 0.1 mg/mL lactoferrin hydrolysates on cell apoptosis of IEC-6 cells incubated for 48 h

程序性細(xì)胞死亡簡稱細(xì)胞凋亡，與許多調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和組織穩(wěn)態(tài)的生理生長控制機(jī)制有關(guān)，是細(xì)胞死亡的主要形式[15]。如表4、5所示，與空白組相比，經(jīng)0.1 mg/mL牛源乳鐵蛋白水解液處理24、48 h后，IEC-6細(xì)胞凋亡率尤其是晚期凋亡率明顯降低。與未熱處理組相比，3 種巴氏殺菌方式對乳鐵蛋白活性無明顯破壞作用。但隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，乳鐵蛋白水解液抑制細(xì)胞凋亡的作用開始減弱。

2.4 巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由于4 種牛源乳鐵蛋白水解物均可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞增殖，本實(shí)驗(yàn)試圖從基因水平闡明這種增殖作用的潛在機(jī)制。因作用24、48 h的增殖趨勢相同，本實(shí)驗(yàn)采用0.1 mg/mL牛源乳鐵蛋白水解液刺激IEC-6細(xì)胞24 h，通過熒光定量PCR計(jì)算細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)量以闡明增殖機(jī)制。

圖2 巴氏殺菌后乳鐵蛋白水解液對細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 2 Effect of lactoferrin hydrolysates on cell-cycle gene expression in IEC-6 cells

如圖2所示，p21是抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的重要基因之一[16]，PCR結(jié)果顯示，與空白組相比，除63 ℃/30 min組外，在其他3 種乳鐵蛋白水解液作用下，p21表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。Cyclin E1可與其激酶CDK2結(jié)合，是調(diào)節(jié)細(xì)胞從G1期到S期過渡的重要基因[17]。與空白組相比，除63 ℃/30 min組外，cyclin E1基因表達(dá)量在其他3 種牛源乳鐵蛋白水解液中均顯著增加（P＜0.05），這表明牛源乳鐵蛋白可推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1/CDK1復(fù)合物是細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，大量的底物蛋白質(zhì)被Cyclin B1/CDK1復(fù)合物在進(jìn)入有絲分裂之前磷酸化，有絲分裂的調(diào)節(jié)與Cyclin B1/CDK1復(fù)合物的活性有關(guān)。PCR結(jié)果顯示，與空白組相比，cyclin B1和CDK1基因在種牛源乳鐵蛋白水解液作用下表達(dá)水平均升高。結(jié)果表明，4 種乳鐵蛋白水解液通過提高cyclin B1、CDK1、cyclin E1基因表達(dá)量，降低基因p21表達(dá)量，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

與未熱處理組相比，除85 ℃/15 s外，其余2 種熱處理方式下的乳鐵蛋白水解液均能顯著降低cyclin B1、CDK1和cyclin E1的表達(dá)水平（P＜0.05），顯著提高p21的表達(dá)水平（P＜0.05），抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，但抑制作用顯著低于空白組。由此說明巴氏殺菌雖可降低乳鐵蛋白的免疫活性，但并未使其完全失活。

3 討 論

隨著冷鏈基礎(chǔ)設(shè)施的完善和“防腐保鮮防熱傷害保活性”理念的普及[18]，巴氏殺菌乳成為液體乳發(fā)展的必要趨勢。通過對巴氏殺菌乳和超高溫瞬時(shí)滅菌乳的比較可知，隨著熱處理強(qiáng)度的增加，乳中的功能性成分如α-乳白蛋白和乳鐵蛋白的含量不斷減少，而巴氏殺菌乳只是輕微的熱處理，在保證衛(wèi)生安全的同時(shí)，更多地保留了牛奶中的活性物質(zhì)[19]。

目前的研究只停留在加熱誘導(dǎo)變性方面，這會(huì)使乳中天然蛋白含量減少，但并沒有直接證據(jù)表明會(huì)使其功能喪失[20]。因此，進(jìn)一步研究熱處理是否破壞乳中免疫活性蛋白的免疫功能十分必要。另外，關(guān)于熱處理對乳鐵蛋白影響的研究雖多，但主要集中于結(jié)構(gòu)[21]、鐵結(jié)合能力和抑菌性等，對其免疫活性雖有涉及[22]，但關(guān)于腸道免疫活性方面鮮有研究。本研究著眼于腸道免疫，利用體外實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)，為新型乳制品加工提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與未熱處理的乳鐵蛋白水解液相比，3 種巴氏殺菌方式并沒有使乳鐵蛋白完全失活，仍可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞的增殖。通過提高cyclin B1、CDK1、cyclin E1基因表達(dá)量，降低p21基因表達(dá)量，增加細(xì)胞在G2/M和S期所占比例，推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，降低細(xì)胞凋亡率。本研究結(jié)果表明，乳鐵蛋白通過促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)腸道免疫。巴氏殺菌可能使乳鐵蛋白的活性基團(tuán)暴露，使乳鐵蛋白形成一種展開的中間構(gòu)象，其構(gòu)象與未經(jīng)過熱處理的乳鐵蛋白不同，但仍具有生物活性[23]。且嬰兒消化道中的消化液，尤其是胃蛋白酶，不能將乳鐵蛋白完全消化，在嬰兒的小腸中仍存在完整的乳鐵蛋白[24]。乳鐵蛋白被腸道上皮細(xì)胞表面的乳鐵蛋白接受器所識(shí)別后，進(jìn)入細(xì)胞核并與特定的DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄[25]，從而顯著地促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的增殖。產(chǎn)后早期是新生兒腸胃結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，乳鐵蛋白可以促進(jìn)嬰兒腸道上皮細(xì)胞的增殖，進(jìn)而改善嬰兒的消化吸收能力，提高嬰兒腸道免疫活性[2]。

最新研究表明，采用添加乳鐵蛋白的嬰兒配方粉喂養(yǎng)0～4 周健康新生兒，并進(jìn)行為期1 年的隨訪調(diào)查，發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白可降低新生兒患下呼吸道感染尤其是哮喘的概率，且在出生后6 周體質(zhì)量增長迅速[26]。乳鐵蛋白作為一種多功能免疫蛋白，已被證實(shí)在臨床方面具有輔助治療作用，可預(yù)防或治療由細(xì)菌、真菌等引起的感染[27-28]。新生兒尤其是早產(chǎn)兒免疫系統(tǒng)尚未成熟，適當(dāng)補(bǔ)充乳鐵蛋白可減少嬰兒促免疫力類藥物的使用，避免給嬰兒肝腎造成負(fù)擔(dān)。

本研究從嬰兒腸道免疫角度出發(fā)，體外模擬嬰兒腸胃環(huán)境，利用乳鐵蛋白水解液刺激腸道細(xì)胞得出最佳劑量，與以往直接使用乳鐵蛋白刺激腸道細(xì)胞而忽略體內(nèi)消化這一重要步驟的做法[29-30]相比更符合人體正常消化代謝規(guī)律。下一步的研究應(yīng)該以此劑量為參照，結(jié)合腸道微生物利用率，通過動(dòng)物及人體喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，最終確定嬰兒配方食品中乳鐵蛋白的最佳添加劑量，使其真正起到提高嬰兒免疫力的作用，為嬰兒配方食品的生產(chǎn)及產(chǎn)品品質(zhì)的提升提供科學(xué)的研究數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

巴氏殺菌后牛源乳鐵蛋白均可通過增加基因cyclin B1、CDK1和cyclin E1的表達(dá)水平，降低p21的表達(dá)水平促進(jìn)IEC-6細(xì)胞增殖，減緩細(xì)胞凋亡。巴氏滅菌雖可部分損傷乳鐵蛋白的免疫活性基團(tuán)，但不能使其完全失活。選擇適宜的工藝參數(shù)如72 ℃、15 s和85 ℃、15 s可最大化地保留乳鐵蛋白的免疫活性。通過體外實(shí)驗(yàn)得出乳鐵蛋白水解液促進(jìn)嬰兒腸道免疫的最佳劑量為0.1 mg/mL。巴氏殺菌可以很好地保留生鮮乳中免疫蛋白的免疫活性，這為現(xiàn)階段乳制品加工工藝參數(shù)設(shè)計(jì)以及營養(yǎng)補(bǔ)充劑添加量提供理論依據(jù)，為國內(nèi)本土生鮮乳加工利用提供新的方向。