乙酰丙酸對沙門氏菌誘導(dǎo)性耐酸響應(yīng)

田牧雨，張一敏，董鵬程，毛衍偉，梁榮蓉，朱立賢,，羅 欣,2

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

沙門氏菌（Salmonella）是與食品安全相關(guān)的最主要的食源性致病菌之一，能引起一系列人類疾病，包括急性高燒發(fā)熱和胃腸炎等[1]。根據(jù)歐洲食品安全管理局的統(tǒng)計(jì)，歐盟每年就有10萬多人被感染[2]。沙門氏菌可在各種惡劣的環(huán)境條件下生長，因此在食品安全方面存在一定的隱患。在肉類加工企業(yè)中，為了減少細(xì)菌（如大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特菌）的污染，屠宰后的胴體在入庫預(yù)冷前采用有機(jī)酸噴淋的方式進(jìn)行減菌處理[3]，或者以鹽的形式添加到加工肉制品中以抑制細(xì)菌生長[4]。最常用的有機(jī)酸是檸檬酸、蘋果酸、乳酸和醋酸等。此外，有研究表明，乙酰丙酸也具有相類似的抑菌效果[5]。美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證乙酰丙酸是一種可以直接添加到食品中的一般認(rèn)為安全類物質(zhì)[6]。

然而，弱酸環(huán)境可以提高沙門氏菌在其他環(huán)境壓力下存活率并影響其毒性[7]。沙門氏菌具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制以保護(hù)其應(yīng)對諸多生物或非生物的不利因素[8-9]。Foster等[10]在1991年首先提出了誘導(dǎo)性耐酸響應(yīng)（acid tolerance response，ATR），隨后，沙門氏菌在酸應(yīng)激條件下存活的適應(yīng)性反應(yīng)得到了廣泛關(guān)注。誘導(dǎo)性耐酸響應(yīng)的定義是指微生物在適度的低pH值環(huán)境中培養(yǎng)一段時(shí)間或暴露在微酸性環(huán)境中（酸適應(yīng)），然后在普遍致命的低pH值環(huán)境中培養(yǎng)產(chǎn)生了抗性（酸激過程），稱作誘導(dǎo)性耐酸響應(yīng)或耐酸反應(yīng)[10-11]。有學(xué)者對不同酸（蘋果酸、檸檬酸、乳酸、醋酸、鹽酸）誘導(dǎo)沙門氏菌產(chǎn)生耐酸能力的研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸誘導(dǎo)能力最強(qiáng)，而鹽酸誘導(dǎo)能力最弱；其中乳酸和醋酸也具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)能力[12]。ATR可增強(qiáng)細(xì)菌在酸性食品中的生存能力，使其在極端的胃酸環(huán)境中存活，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的生命健康[13]。沙門氏菌的ATR受血清型、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、pH值、酸化劑種類等多種條件的影響[14]。沙門氏菌在弱酸環(huán)境下的ATR是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一個(gè)復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，目前關(guān)于ATR的研究主要從pH值穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)、應(yīng)激蛋白分子的調(diào)控、細(xì)胞膜組成和流動性控制等方面進(jìn)行研究。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了幾種有機(jī)酸（L-乳酸、醋酸和乙酰丙酸）和鹽酸在即食肉制品pH 6.0和肉極限pH 5.4下對兩株不同血清型沙門氏菌的生長和ATR的影響，以及沙門氏菌在酸脅迫下的pHi變化，為進(jìn)一步探究沙門氏菌的ATR提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（S. typhimurium ATCC 14028）和分離自我國肉牛屠宰企業(yè)中常見的德爾卑沙門氏菌（S. Derby），由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院畜產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室保存。

腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA） 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；L-乳酸 上海麥克林生物有限公司；醋酸、乙酰丙酸 上海阿拉丁工業(yè)公司；羧基熒光素琥珀酰亞胺脂 （5,6-carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE） 美國AAT Bioquest公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S210 pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司；生物安全柜美國Thermo Scientific公司；紅外線滅菌器 中國力康公司；804R離心機(jī) 德國Eppendorf公司；RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

原始菌株置于-80 ℃條件下貯藏。工作菌株按照1%的接種比例從貯藏液轉(zhuǎn)接至BHI培養(yǎng)基（pH 7.4）中，37 ℃過夜（約18 h）培養(yǎng)。

1.3.2 生長曲線的測定

本實(shí)驗(yàn)對兩株沙門氏菌在五種培養(yǎng)基中的生長曲線分別進(jìn)行了測定。空白對照為100 mL BHI培養(yǎng)基（pH 7.4），鹽酸對照組用鹽酸調(diào)BHI培養(yǎng)基pH值分別為6.0和5.4。三個(gè)處理組為分別添加了L-乳酸、醋酸及乙酰丙酸的BHI培養(yǎng)基（pH值分別為6.0和5.4）。將上述所述的過夜（約18 h）培養(yǎng)的菌液，分別于4 ℃下離心（5 000×g，10 min）收集菌體（兩株菌的細(xì)胞濃度約為108CFU/mL）。按1%的接種量，將其接種至上述各種BHI培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期。每小時(shí)收集樣品，適度稀釋后涂布于BHIA，并在37 ℃培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)。以lg（CFU/mL）表示存活細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間變化，然后將數(shù)據(jù)擬合到Gompertz模型[15]生成生長曲線方程（1）。

式中：N0是初始細(xì)胞計(jì)數(shù)的對數(shù)（lg（CFU/mL））；C是初始和最終細(xì)胞數(shù)之間的差值（lg（CFU/mL））；k是最大比生長速率/h-1；LPD是遲滯期持續(xù)時(shí)間（lagphase duration）/h；X培養(yǎng)時(shí)間/h；Y是細(xì)胞計(jì)數(shù)的對數(shù)（lg（CFU/mL））。

生長動力學(xué)參數(shù)為：LPD、k、最大生長密度（maximum population density，MPD）（lg（CFU/mL））、達(dá)到穩(wěn)定期所需的時(shí)間（time needed to reach the stationary-phase，TSP）/h和增代時(shí)間（generation time，GT）/h。GT根據(jù)式（2）計(jì)算。

式中：0.301為系數(shù)。

1.3.3 誘導(dǎo)性耐酸的測定

參考Liu Jiamei等[13]的方法，取1 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期（10～48 h）的酸適應(yīng)或非酸適應(yīng)的菌液（兩株菌的細(xì)胞濃度約為108CFU/mL）離心（8 000×g，5 min，4 ℃）后接種于9 mL的pH 3.0的BHI溶液（使用HCl調(diào)節(jié)）中酸激2 h。分別在酸激前和酸激2 h后，梯度稀釋后涂布于BHIA平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。殘存率以酸激前后菌落數(shù)比值的對數(shù)表示，并按照式（3）計(jì)算。

式中：NC為酸激后菌落數(shù)（lg（CFU/mL）），N0為酸激前菌落數(shù)（lg（CFU/mL））。3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行。

1.3.4 pHi的測定

參照Breeuwer等[16]的方法，分別對上述兩株沙門氏菌在不同培養(yǎng)條件中的pHi進(jìn)行測定。

預(yù)處理：將兩株沙門氏菌分別接種于如上所述的不同pH值條件下的100 mL空白對照培養(yǎng)基、鹽酸對照培養(yǎng)基、L-乳酸、醋酸和乙酰丙酸的BHI培養(yǎng)基中。生長至穩(wěn)定期，離心收集（8 000×g，10 min），用緩沖液D（含50 mmol/L HEPES緩沖液，5 mmol/L EDTA，pH 7.2）洗滌1 次后將其懸浮在等體積的緩沖液D中，加入一定量的終濃度為1.0 μmol/L CFSE，37 ℃避光溫育30 min后，離心（8 000×g，0 ℃，15 min）收集菌體，在同樣的條件下，用緩沖液E（含50 mmol/L KH2PO4-NaOH緩沖液，pH 6.8）洗滌1 次，去上清液，然后將其懸浮在緩沖液E中，再加入一定量的濃度為10 mmol/L的葡萄糖，37 ℃溫育30 min后，用緩沖液E洗滌1 次，然后再將其懸浮在緩沖液E中細(xì)胞密度為108CFU/mL，避光冷藏備用。

建立pHi標(biāo)準(zhǔn)曲線：pHi標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（含50 mmol/L氨基乙酸、50 mmol/L檸檬酸、50 mmol/L Na2HPO4·2H2O、50 mmol/L KCl）調(diào)節(jié)pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，共8 種緩沖液。將上述進(jìn)行熒光標(biāo)記的菌液離心（8 000×g，4 ℃，10 min），然后將其懸浮在相等體積、pH值不同的8 種緩沖液中，制成一系列菌懸液，再加入一定量終濃度為1 μmol/L的纈氨霉素和終濃度為1 μmol/L尼日利亞菌素，使兩株沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)外pH值達(dá)到平衡，15 min后，用熒光分光光度計(jì)測定發(fā)射波長為520 nm、激發(fā)波長分別為490 nm和435 nm的熒光強(qiáng)度（激發(fā)縫寬為5 nm，發(fā)射縫寬為10 nm）。以490 nm與435 nm的熒光強(qiáng)度的比值（R490nm/R435nm）為縱坐標(biāo)，pHi標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的pH值為橫坐標(biāo)，數(shù)據(jù)經(jīng)R軟件回歸處理后，作出R490nm/R435nm隨pH值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

pHi測定：在發(fā)射波長為520 nm、激發(fā)波長為490 nm和435 nm下，用熒光分光光度計(jì)分別測定上述處理后熒光標(biāo)記的樣品（懸浮在緩沖液E中）的熒光強(qiáng)度，求得R490nm/R435nm的比值；再根據(jù)制作的R490nm/R435nm隨pH值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，則可計(jì)算出R490nm/R435nm所對應(yīng)的pHi。進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 9.0的混合模型（MIXED Procedure）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，菌株、pH值和酸的種類作為對細(xì)菌殘存率和pHi影響的固定因素，實(shí)驗(yàn)重復(fù)及固定效應(yīng)的交互作用為隨機(jī)因素，數(shù)據(jù)用平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤（standard error，SE）表示，差異顯著水平P＜0.05；采用Origin Pro 9.4軟件和R 3.5.1軟件作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值和酸化劑種類對沙門氏菌生長動力學(xué)參數(shù)的影響

在不同pH值（5.4和6.0）下，對兩株沙門氏菌在鹽酸、L-乳酸、乙酸和乙酰丙酸酸化的BHI（不含葡萄糖）和非酸化BHI培養(yǎng)基（pH 7.4）中的生長情況進(jìn)行了測定。表1、2中顯示了沙門氏菌的主要生長參數(shù)。Gompertz方程的決定系數(shù)（R2）均大于0.95，表明該方程能很好地?cái)M合沙門氏菌在不同培養(yǎng)基中的生長情況。在生長培養(yǎng)基中添加有機(jī)酸可提高GT、TSP和LPD，并降低k和MPD。pH值為6.0時(shí)，不同有機(jī)酸對沙門氏菌的抑制效果與pH 5.4相似。本研究發(fā)現(xiàn)，低pH值延遲了沙門氏菌的生長，GT、TSP和LPD均較高，而MPD和k則較低。pH值為5.4時(shí)的環(huán)境對沙門氏菌有較好的抑菌效果且有機(jī)酸的抑菌效果高于無機(jī)酸。這與先前的研究在一定的pH值下，乳酸比鹽酸具有更強(qiáng)的抑制作用是一致的[17]。

圖1、2顯示了不同pH值（5.4和6.0）下兩株不同血清型的沙門氏菌在非酸化BHI（pH 7.4）和酸化BHI培養(yǎng)基（鹽酸、L-乳酸、乙酸和乙酰丙酸）中的生長曲線。有機(jī)酸存在解離和未解離兩種形式，未解離的有機(jī)酸由于與細(xì)菌的細(xì)胞膜具有相似相溶的特性，可經(jīng)自由擴(kuò)散直接進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，由于細(xì)菌內(nèi)部pH值接近中性，未解離的有機(jī)酸在細(xì)菌內(nèi)部解離，降低了膜內(nèi)pH值，削弱菌膜的跨膜梯度，進(jìn)而抑制了細(xì)菌的生長[18]。

表1 鼠傷寒沙門氏菌的生長動力學(xué)參數(shù)Table 1 Growth kinetic parameters of S. typhimurium

表2 德爾卑沙門氏菌的生長動力學(xué)參數(shù)Table 2 Growth kinetic parameters of S. Derby

圖1 鼠傷寒沙門氏菌在5 種培養(yǎng)基中的生長擬合曲線Fig. 1 Growth curves of S. typhimurium in various media

圖2 德爾卑沙門氏菌在5 種培養(yǎng)基中的生長擬合曲線Fig. 2 Growth curves of S. Derby in various media

結(jié)果表明pH 5.4時(shí)，有機(jī)酸對沙門氏菌的抑制作用明顯增強(qiáng)，其中乙酰丙酸對沙門氏菌的生長抑制作用最強(qiáng)，GT（3 h）和TSP（48 h）均較高（表1、2）。酸化劑的抑菌強(qiáng)弱為：乙酰丙酸＞醋酸＞L-乳酸＞鹽酸。這些結(jié)果與álvarez-Ordó?ez等[19]研究的結(jié)果一致，該學(xué)者測試了鼠傷寒沙門氏菌在不同pH值和不同溫度下用醋酸、乳酸、檸檬酸和鹽酸酸化的BHI中生長的能力，發(fā)現(xiàn)無論pH值和溫度如何變化，酸抑制細(xì)菌生長的順序均為：醋酸＞乳酸＞檸檬酸＞鹽酸。與乳酸和醋酸相比，乙酰丙酸具有更好的耐熱性，更少的蒸發(fā)量，這可以提供最有效的殺菌效果[5]。本研究表明pH值為5.4的乙酰丙酸可以一定程度上抑制沙門氏菌的生長。

2.2 誘導(dǎo)性耐酸的測定

殘存率是比較微生物的耐酸能力的重要指標(biāo)。由表3可知，在弱酸性pH值下預(yù)適應(yīng)顯著增強(qiáng)了沙門氏菌的耐酸性。與非酸適應(yīng)性細(xì)胞相比，酸適應(yīng)的沙門氏菌細(xì)胞在pH 3.0的BHI培養(yǎng)基中殘存率顯著提高（P＜0.05），沙門氏菌在弱酸環(huán)境中產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐酸性，有機(jī)酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的沙門氏菌的ATR顯著高于在無機(jī)酸環(huán)境中培養(yǎng)的沙門氏菌。另外，研究發(fā)現(xiàn)不同血清型菌株之間ATR存在差異，S. typhimurium對不同的有機(jī)酸產(chǎn)生的ATR差異顯著（P＜0.05），而乙酰丙酸處理的S. Derby的殘存率在不同pH組存在顯著差異（P＜0.05）。

研究表明，在pH 5.4酸適應(yīng)后產(chǎn)生的耐酸性顯著高于pH 6.0酸適應(yīng)后的耐酸性，pH 5.4提高了沙門氏菌對強(qiáng)酸的敏感性。在pH值為6.0的L-乳酸誘導(dǎo)下，pH 3.0酸激后S. typhimurium的菌落數(shù)減少約2.4（lg（CFU/mL）），而pH 5.4酸適應(yīng)后，pH 3.0酸激后細(xì)菌的菌落數(shù)僅減少0.9（lg（CFU/mL））。該結(jié)果與劉佳玫等[20]報(bào)道的結(jié)果一致，在溫和的低pH值環(huán)境下培養(yǎng)沙門氏菌使其耐酸性增強(qiáng)，即ATR。Burin等[21]發(fā)現(xiàn)在pH 6.0或pH 5.0時(shí)，沙門氏菌對有機(jī)酸的適應(yīng)能力較強(qiáng)。然而，當(dāng)pH值較低（pH 4.0）時(shí)，細(xì)菌在6～24 h后無法存活。另外Samelis等[22]的報(bào)告發(fā)現(xiàn)，酸適應(yīng)使沙門氏菌對低溫環(huán)境更敏感，在低溫（10 ℃）下生長的鼠傷寒沙門氏菌與在30 ℃下獲得的細(xì)胞相比，耐酸性降低。因此有機(jī)酸協(xié)同低溫加工貯藏可作為控制食品微生物的方法。

表3 沙門氏菌在BHI（pH 3.0）酸激2 h后的殘存率Table 3 Survival rates of Salmonella challenged in BHI at pH 3.0 for 2 h

不同酸化劑處理的沙門氏菌殘存率存在一定差異（表3）。耐酸性強(qiáng)弱大致為：L-乳酸＞醋酸＞乙酰丙酸＞鹽酸，其中L-乳酸和醋酸耐酸性之間無顯著性差異，乙酰丙酸耐酸性較弱且顯著低于其他兩組有機(jī)酸（P＜0.05）。該結(jié)果與Zhang Yimin等[23]報(bào)道的酸適應(yīng)性單增李斯特菌在pH 6.0乙酰丙酸與乳酸和醋酸中的存活率無顯著性差異的結(jié)果不同，本研究發(fā)現(xiàn)乙酰丙酸適應(yīng)下的沙門氏菌殘存率低，說明其殺菌效果最強(qiáng)，這意味著乙酰丙酸可作為食品加工中一種理想的殺菌劑。但是這些結(jié)果需要進(jìn)一步擴(kuò)大ATR的研究以應(yīng)對不同的環(huán)境條件，以促進(jìn)設(shè)計(jì)和提高風(fēng)險(xiǎn)評估研究的準(zhǔn)確性。

2.3 pHi的變化

pHi與細(xì)菌產(chǎn)生ATR的能力密切相關(guān)，在低pH值環(huán)境中，細(xì)胞質(zhì)會通過排出質(zhì)子來維持pHi的穩(wěn)定[24]。測定pHi變化可以進(jìn)一步探究沙門氏菌細(xì)胞在酸脅迫下維持pHi的能力。圖3、4分別為S. typhimurium和S. Derby在BHI培養(yǎng)基中生長至穩(wěn)定期pHi標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過R軟件回歸處理后得到的模型檢驗(yàn)P＜0.01，R2趨近于1，擬合度較好。這表明，本研究所建立的以CFSE為熒光指示劑測定沙門氏菌pHi的方法是穩(wěn)定的。因此，該方法在后續(xù)研究中被進(jìn)一步用于測定不同條件下的pHi，以揭示沙門氏菌的耐酸性。由圖3、4可知，隨著pHi的升高，熒光強(qiáng)度比值（R490nm/R435nm）呈升高趨勢。

表4為S. Typhimurium和S. Derby在不同pH值、不同酸培養(yǎng)基中生長至穩(wěn)定期后的pHi。研究表明胞外pH值為5.4和6.0時(shí)，有機(jī)酸處理的沙門氏菌pHi與鹽酸對照組相比普遍存在差異，有機(jī)酸在該pH值狀態(tài)下誘導(dǎo)的致死酸應(yīng)激使有機(jī)酸比無機(jī)酸更有效地緩解pHi。這與ATR結(jié)果一致，表明沙門氏菌有機(jī)酸誘導(dǎo)的耐酸反應(yīng)與pHi的穩(wěn)定能力有關(guān)。Cheng Changyong等[25]研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌在乙酸和乳酸存在下，在細(xì)胞外pH 4.5下維持pHi的能力受到損害，但在鹽酸和檸檬酸處理組中沒有影響，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。不同有機(jī)酸處理對沙門氏菌pHi的影響存在差異。pH 6.0的L-乳酸處理組沙門氏菌pHi顯著高于醋酸和乙酰丙酸處理的pHi（P＜0.05）；而在pH 5.4時(shí)，沙門氏菌的pHi有機(jī)酸處理組之間無顯著性差異。

不同的胞外pH值對其pHi的影響有一定差異，pH 5.4條件下細(xì)菌更易維持pHi穩(wěn)定，其中鹽酸和乙酰丙酸處理組的細(xì)菌pHi差異顯著（P＜0.05）。同時(shí)pH 5.4時(shí)其耐酸能力較強(qiáng)，這說明在弱酸壓力條件下細(xì)菌pHi的穩(wěn)定能力與其酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐強(qiáng)酸能力成正比，與ATR結(jié)果相一致。有研究指出蠟樣芽孢桿菌在低pH值的生長過程中能夠產(chǎn)生ATR，這種適應(yīng)性依賴于pHi穩(wěn)態(tài)，并且在谷氨酸、精氨酸和賴氨酸存在下增強(qiáng)[26]。張群等[27]研究發(fā)現(xiàn)琥珀酸放線桿菌在pH 4.7和pH 4.5時(shí)，pHi升高；而pH值大于5.2時(shí)，pHi降低，該研究表明這是由于細(xì)胞膜受到損傷使其通透性增大，pHi受到緩沖液影響的結(jié)果。另外，兩株不同血清型的沙門氏菌在有機(jī)酸處理下pHi存在一定差異，其中乙酰丙酸處理組兩株沙門氏菌的pHi均差異顯著（P＜0.05）。該結(jié)果與Cheng Changyong等[25]報(bào)道的結(jié)果一致，他測定了不同酸環(huán)境下不同血清型單增李斯特菌的pHi變化，發(fā)現(xiàn)不同血清型單增李斯特菌維持pHi穩(wěn)定的能力存在差異。本研究表明細(xì)胞外部pH值和有機(jī)酸環(huán)境共同決定了pHi的穩(wěn)定性，在有機(jī)酸存在的弱酸培養(yǎng)條件中，S. typhimurium胞內(nèi)pH值的波動較小。結(jié)合ATR結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH值為5.4和6.0的誘導(dǎo)條件中兩株沙門氏菌均產(chǎn)生顯著的ATR，細(xì)菌維持pHi穩(wěn)態(tài)的能力與其在酸性條件下的生長和存活狀況有關(guān)。在一定細(xì)胞外pH值下有機(jī)酸處理對pHi的影響也是沙門氏菌產(chǎn)生ATR的重要因素。

圖3 鼠傷寒沙門氏菌在BHI培養(yǎng)基中生長至穩(wěn)定期pHi標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Standard curve of fluorescent intensity ratio versus intracellular pH of stationary phase S. typhimurium cultured in BHI medium

圖4 德爾卑沙門氏菌在BHI培養(yǎng)基中生長至穩(wěn)定期pHi標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 4 Standard curve of fluorescent intensity ratio versus intracellular pH of stationary phase S. Derby cultured in BHI medium

表4 兩株沙門氏菌在不同培養(yǎng)條件中生長至穩(wěn)定期pHiTable 4 Intracellular pH of stationary phase Salmonella cultured in different media

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)乙酰丙酸殺菌效果最好，同時(shí)其產(chǎn)生耐酸性能力弱，是一種理想的殺菌劑。在酸適應(yīng)和酸激過程中，不同因素的相互作用對ATR有很大的影響且不同血清型的沙門氏菌ATR差異顯著（P＜0.05）。沙門氏菌在極端酸性環(huán)境中存活的能力可根據(jù)先前的生長條件而發(fā)生顯著變化。pH 6.0的環(huán)境顯著降低了細(xì)菌的耐酸性（P＜0.05），而耐酸性的產(chǎn)生伴隨著pHi的變化，在一定細(xì)胞外pH值下有機(jī)酸處理對pHi的影響也是沙門氏菌產(chǎn)生ATR的重要因素。其中涉及到多種機(jī)制的協(xié)同作用還有待進(jìn)一步探究。

沙門氏菌對pH 5.4和pH 6.0的適應(yīng)性強(qiáng)調(diào)了在食品加工中利用有機(jī)酸殺菌時(shí)適當(dāng)監(jiān)測pH值變化的重要性。另外，有機(jī)酸和低溫[28]、乙醇[29]、高壓[30]等的聯(lián)合處理也被證明是一種良好的選擇。因此在食品加工過程中采用聯(lián)合殺菌可作為防止該病原微生物生長和存活的一種策略。