王子燚，孫 慧，李希希，霍龍文，王 猛綜述，于雪凡審校

強直性肌營養(yǎng)不良1型(Myotonic dystrophy type 1,DM1)是一種常染色體顯性遺傳性神經(jīng)肌肉疾病。其發(fā)病的核心機制是由于DM1蛋白激酶(DMPK)基因3’未翻譯區(qū)域的胞嘧啶-胸腺嘧啶-鳥嘌呤(CTG)擴增所引起的轉(zhuǎn)錄RNA功能的改變，由此引起的下游事件導(dǎo)致一系列臨床癥狀。該病由于具有極大的遺傳變異性及臨床異質(zhì)性，因此給臨床診斷與鑒別帶來極大的困難。近年來，由于DM1患者具有遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象，CTG的重復(fù)次數(shù)不斷擴大，在理解病理生理機制方面取得了巨大的進展。 DNA水平上三核苷酸重復(fù)序列的異常擴增成為DM1的導(dǎo)火索，本文綜述了CTG重復(fù)序列的不穩(wěn)定性以及CTG擴增與臨床癥狀的關(guān)系，旨在闡述兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系。

1 CTG重復(fù)序列的不穩(wěn)定性及相關(guān)機制

DMPK基因CTG重復(fù)擴增是導(dǎo)致DM1的致病突變，擴增的CTG重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生有毒的功能效應(yīng)的CUG-RNA，從而導(dǎo)致疾病癥狀[1]。但驅(qū)動這種擴增的潛在突變尚未確定，有人推測DNA錯配修復(fù)機制以及參與二級DNA結(jié)構(gòu)的機制，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)或R-環(huán)，可能以某種形式參與其中[2]。DM1患者發(fā)病年齡從胎兒到中老年不等，并影響多組織系統(tǒng)。由于在DM1患者的精子和未成熟卵母細胞中已經(jīng)存在CTG重復(fù)長度的變化，這表明CTG不穩(wěn)定性主要發(fā)生在生殖細胞胚胎早期的有絲分裂期間[3]。DM1小鼠模型顯示CTG擴張已經(jīng)存在于精原細胞中，在7周齡的精子中就已經(jīng)出現(xiàn)了對擴張的生發(fā)嵌合現(xiàn)象，此外CTG重復(fù)數(shù)目隨著年齡的增長而繼續(xù)增加且獨立于減數(shù)分裂過程[4]。在妊娠第13～16 w，胚胎在組織中CTG數(shù)目變得不穩(wěn)定且并隨著時間的推移繼續(xù)擴增，其中心臟、皮膚最為明顯[5]。上世紀(jì)末，Southern blotting結(jié)果顯示在不同組織中的CTG重復(fù)擴增高度不同，肌肉、心臟和睪丸中的CTG重復(fù)長度比血液、小腦和胸腺中的CTG重復(fù)長度更大[6]。由于DM1患者存在這種體細胞嵌合現(xiàn)象，因此很難通過患者體細胞的CTG重復(fù)數(shù)目來預(yù)測下一代。但是在DM1血液樣本中，CTG重復(fù)長度的平均值隨著時間的推移而增加，并且取決于重復(fù)序列的初始大小[6]。這表明重復(fù)的有絲分裂不穩(wěn)定在整個生命中持續(xù)存在。擴張的程度與最初的重復(fù)大小相關(guān)。

2 錯配修復(fù)途徑在DM1中起到的關(guān)鍵作用

三核苷酸重復(fù)擴增不僅降低了DMPK基因所表達的蛋白或mRNA水平，還改變了相鄰的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，減少了相鄰基因的表達，如下游的SIX5基因和上游的DMWD基因[7]。最近假說提出，CTG重復(fù)序列周圍的甲基化導(dǎo)致SIX5基因表達降低的原因，可能對精原細胞有害，從而阻止父系遺傳后大量重復(fù)序列擴張的傳播[8]。相反，當(dāng)受影響的母親攜帶從80到250個CTG重復(fù)序列的突變等位基因時，CTG數(shù)目不會受到甲基化的影響，從而在下一代會更大，因此先天性強直性肌營養(yǎng)不良往往來源于母系遺傳[9]。由此可以發(fā)現(xiàn)DNA修復(fù)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳變化都會影響CTG重復(fù)不穩(wěn)定的動態(tài)。每個過程可能以多種組合的方式參與，其有效性在不同的組織中可能有所不同，并可能導(dǎo)致的DM1患者之間的差異。

表觀遺傳學(xué)的改變被認為是DM1患者三聯(lián)體重復(fù)不穩(wěn)定和表型變異的修飾因素，其中甲基化修飾在DNA水平上起到了巨大作用，焦磷酸測序數(shù)據(jù)顯示，DMPK基因內(nèi)的DNA甲基化可以改善呼吸參數(shù)和肌肉力量，而與CTG重復(fù)長度無關(guān)[10]。幾個DM1小鼠模型已證明錯配修復(fù)途徑在CTG重復(fù)不穩(wěn)定動力學(xué)中的作用，其中MutSβ復(fù)合體(MSH2-MSH3)在CTG重復(fù)擴張的形成中至關(guān)重要[11]。MSH3作為錯配修復(fù)基因，其表達是衡量三聯(lián)體不穩(wěn)定程度的一個重要參數(shù)，并被認為是這一過程中的一個限制因素。在DM1轉(zhuǎn)基因小鼠中，MSH3是形成代際CTG擴增的限制因子[12]。此外，遺傳關(guān)聯(lián)分析表明，MSH3/DHFR3個串聯(lián)重復(fù)等位基因，稱為3a等位基因，可能會降低DM1患者的體細胞率，以及延遲發(fā)病[13]。不穩(wěn)定性的水平是高度遺傳的，這意味著不同的DM1個體存在特異性的反式遺傳修飾的作用。識別這些反式作用的基因修飾物將有助于制定新的治療方法，從而減少體細胞擴展的積累，并可能為這些因素在普通人群中癌癥、衰老和遺傳性疾病的發(fā)展中所起的作用提供線索。

3 CTG重復(fù)擴增數(shù)目的多少與臨床異質(zhì)性之間關(guān)聯(lián)緊密

DMPK基因內(nèi)擴展的CTG重復(fù)序列被轉(zhuǎn)錄成RNA但不被翻譯，這些RNA與各種剪接調(diào)節(jié)因子形成聚集體，這反過來會損害多個基因在各種組織中的轉(zhuǎn)錄，從而影響下游各器官功能基因的表達[14]。一般說來CTG重復(fù)擴增較大的患者發(fā)病年齡較早，癥狀較重。國內(nèi)外多家研究中心試圖將CTG重復(fù)長度與癥狀嚴(yán)重程度、臨床特征以及該病相關(guān)并發(fā)癥聯(lián)系起來。由于DM1患者的體細胞嵌合性，因此CTG與臨床異質(zhì)性之間關(guān)系大多以血清白細胞或研究的目的細胞中CTG數(shù)量含量為評價標(biāo)準(zhǔn)。重復(fù)次數(shù)較多的患者如果在最初檢查時已經(jīng)有癥狀，隨著血液中的重復(fù)次數(shù)增加，在5 y內(nèi)臨床癥狀進展的可能性極大，也有部分DM1基因攜帶者可能會一直無癥狀，直到高齡。先前通過肌肉損傷評定量已驗證對于DM1患者的核心癥狀(肌無力、肌強直以及活動耐力下降)與CTG重復(fù)擴增存在明顯的正相關(guān)[15]。同樣，CTG大小對于DM1患者多系統(tǒng)并發(fā)癥亦存在極強的關(guān)聯(lián)性。

3.1 CTG大小與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)并發(fā)癥 通過彌散加權(quán)呈像(Diffusion Tensor Imaging，DTI)可以發(fā)現(xiàn)CTG擴增明顯的患者腦組織多部位各向異性分?jǐn)?shù)(Fractional Anisotropy,FA)明顯下降，提示CTG擴增程度越高，F(xiàn)A所呈現(xiàn)的纖維組織受損越重[16]。DM1患者包括雙側(cè)眶額葉、額葉前部、島葉、外囊和枕葉皮質(zhì)在內(nèi)的廣泛區(qū)域內(nèi)的彌散度指標(biāo)下降。此外，厚度與這些區(qū)域的CTG重復(fù)數(shù)呈負相關(guān)。DM1患者的皮質(zhì)脊髓束(CST)中的DTI參數(shù)與遺傳因素和運動性能之間存在顯著的關(guān)系。這些發(fā)現(xiàn)提示CST的介入反映了運動束的惡化，可能在臨床肌強直中起重要作用。此外，皮質(zhì)灰質(zhì)體積與CST中DTI測量值之間的直接關(guān)系表明，CST中白質(zhì)異常與DM1患者感覺運動皮質(zhì)的體積減少密切相關(guān)[17]。同時，灰質(zhì)和白質(zhì)的完整性與CTG重復(fù)序列相關(guān)，但CTG重復(fù)序列大小與腦結(jié)構(gòu)改變之間的關(guān)系尚未得到證實，亦有一些相互矛盾的研究。DM1患者在社會認知及情緒調(diào)節(jié)方面存在明顯障礙,已經(jīng)證明這些高級功能障礙與大腦結(jié)構(gòu)和功能障礙密不可分。部分患者對自己的癥狀漠不關(guān)心，這也是由于DM1導(dǎo)致的認知能力下降所致。在IQ分?jǐn)?shù)和CTG重復(fù)的大小之間沒有統(tǒng)計學(xué)上顯著的相關(guān)性。DM1與廣泛分布的灰質(zhì)和白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)變化有關(guān)。一些與認知相關(guān)的區(qū)域與CTG重復(fù)顯著相關(guān)[18],由于大腦由高度專業(yè)化的功能區(qū)組成，因此與CTG重復(fù)大小有關(guān)的區(qū)域信息將具有重要的臨床意義。

3.2 CTG大小與心血管系統(tǒng)相關(guān)并發(fā)癥 雖然CTG重復(fù)擴增引起多系統(tǒng)受累，但患者的主要死亡原因是肌肉萎縮和心臟性猝死。過三分之二的DM1患者經(jīng)歷嚴(yán)重的心臟功能障礙，包括心臟傳導(dǎo)延遲、致命的竇房和房室傳導(dǎo)阻滯、心房顫動和室性心律失常[19]。對于CTG重復(fù)大小作為傳導(dǎo)障礙或心臟事件的預(yù)測指標(biāo)是否有價值，目前文獻存在較多分歧，尚無法達到統(tǒng)一共識。CTG 數(shù)量大小是否可以循環(huán)系統(tǒng)障礙的并發(fā)癥的預(yù)測因素仍然需要大樣本進行統(tǒng)計。近日相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在DM1心臟組織中，CTG擴增引起的RNA結(jié)合蛋白RBFOX2的非肌肉剪接異構(gòu)體上調(diào)是導(dǎo)致了DM1個體的心臟傳導(dǎo)缺陷的重要因素。RBFOX240上調(diào)的程度與CTG重復(fù)擴增的大小亦是當(dāng)下重點研究方向[20]。這就意味著修飾基因以及錯配修復(fù)機制在DNA水平上對CTG的影響起到了至關(guān)重要的作用。

3.3 CTG大小與呼吸系統(tǒng)相關(guān)并發(fā)癥 DM1患者較其他患者更早出現(xiàn)呼吸功能不全。Salvatore等人通過對268名DM1患者進行多中心橫斷面研究發(fā)現(xiàn)白細胞CTG擴張大小與呼吸肌受累的大部分功能參數(shù)、勞力性呼吸困難顯著相關(guān)，且證實CTG是DM1患者呼吸受限的獨立預(yù)測因子[21]。對于DM1患者，睡眠中的呼吸障礙更為常見，日間睡眠亢進，伴有睡眠潛伏期短，入睡時眼球運動迅速，下丘腦下泌乳素系統(tǒng)異常這些均可能歸因于睡眠呼吸暫停[22]。在慢性呼吸功能不全的主觀癥狀中，只有疲勞性呼吸困難與限制性模式顯著相關(guān)，這是由于呼吸困難不僅僅是由于肺部功能損害，骨骼肌無力也是其主要原因，這與DM1中的特征密切相關(guān)，而CTG作為二者共同的預(yù)測因素，其在臨床工作中具有評價預(yù)后的價值。

3.4 CTG大小與眼部相關(guān)并發(fā)癥 白內(nèi)障、上瞼下垂、眼動異常和低眼壓是DM1中最公認的眼部問題，其中前三者與運動功能障礙有關(guān)。眼壓降低也很常見，但似乎與運動障礙無關(guān)[23]。與DM1相關(guān)的晶狀體混濁似乎具有完全的遺傳性，也就是說，近100%的DM1患者存在白內(nèi)障[24]。即使特別小的CTG重復(fù)序列也會引起眼部癥狀的發(fā)生，而且其嚴(yán)重程度會隨著病程的進展而加重，因此兩者之間的關(guān)系則顯得撲朔迷離。一項對于韓國DM1患者眼部研究結(jié)果表明CTG>700的DM1患者行白內(nèi)障摘除的幾率遠高于<700的患者，即兩者呈正相關(guān)[25]，但這需要更大規(guī)模的研究來證實。

除了上述并發(fā)癥以外，DM1患者惡性腫瘤的風(fēng)險也有所增加，患癌癥的風(fēng)險增加了約一倍，最常見的有皮膚癌、甲狀腺癌和乳房癌等[26]。消化功能障礙、內(nèi)分泌紊亂、周圍神經(jīng)病和其他發(fā)育和退化表現(xiàn)也是DM1患者的常見表現(xiàn)，其與CTG的重復(fù)數(shù)目之間的關(guān)系由于原始研究的不足，因此尚無定論。

4 總結(jié)與展望

自從發(fā)現(xiàn)DM1的CTG重復(fù)序列的不穩(wěn)定性以來，CTG重復(fù)序列擴張的動力學(xué)及其與疾病的各個方面的關(guān)系方面均取得了相當(dāng)大的進展。統(tǒng)計學(xué)的發(fā)展使人們有可能改進重復(fù)序列的大小和臨床癥狀之間的相關(guān)性，并揭示了DM1中明顯的一些變異性。RNA的毒性作用起源于DM患者DMPK基因的非編碼區(qū)的CTG重復(fù)擴增，導(dǎo)致在S期復(fù)制叉停滯，以及細胞應(yīng)激反應(yīng)[27]。因此致病過程在DNA重復(fù)擴增階段最為簡單也最好把控，無需針對下游再行過多干預(yù)。對于DM1患者，藥物作用的等位基因只有一個，所以理論上用藥的種類以及濃度都應(yīng)少于作用于特定的下游途徑。因此在DNA水平上的如果能夠減少GTC擴增數(shù)量則可獲得最有效的治療效果，但在技術(shù)上存在相當(dāng)大的難度。隨著CRISPR/Cas9基因編輯平臺的廣泛應(yīng)用[28]，DM1的基因治療手段也逐漸被完善，從而使得遺傳學(xué)和修飾物的鑒定取得進展，這將有助于在未來的臨床試驗中對患者進行分層與治療。因此對于DM1患者的三核苷酸重復(fù)序列的不穩(wěn)定性來說，更好地了解這種變異性的來源對于開發(fā)新的具有挑戰(zhàn)性的療法非常重要，特別是對于在個性化治療的道路上有重大意義。