5種水仙屬植物的核型分析

劉 洋, 李全超, 肖瑤宇, 李 琳, 何炎森, 陳曉靜

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建 漳州 363000)

水仙屬(Narcissus)植物，分布于中歐、地中海、西亞和北非，有25～30種原始物種[1]，經(jīng)過幾千年的自然雜交，形成復(fù)雜的雜交群體.水仙屬植物染色體數(shù)目和倍性復(fù)雜，至今親緣關(guān)系仍不夠明晰.關(guān)于水仙細(xì)胞學(xué)方面的研究已有一些報道[1-17]，染色體基數(shù)有x=7、10和11等3種基本類型，也有一些染色體基數(shù)為x=5[3]、12和14[17]的報道，體細(xì)胞染色體數(shù)目為10～56[3,6,12]，在自然環(huán)境中普遍存在三倍體和非整倍體.多花水仙染色體基數(shù)有x=10和11兩種，體細(xì)胞染色體數(shù)目為20～34[2,5].中國水仙(NarcissustazettaL. var.chinensisRoem.)是多花水仙變種，主要栽培品種的染色體數(shù)目大多為2n=30的三倍體不育類型[4,7,10-13,15,18]，因此，通過有性雜交很難獲得雜種后代.

傳統(tǒng)的分類方法主要是基于形態(tài)特征，由于天然雜交的頻繁發(fā)生，難以準(zhǔn)確描述水仙物種間的界限和親緣關(guān)系.核型分析可以為水仙的進(jìn)化、地理分布和形態(tài)分化提供更為準(zhǔn)確的信息.近年來，陸續(xù)從國外引進(jìn)一些水仙品種類型，并進(jìn)行了小范圍的栽培試驗(yàn)，但這些材料能否作為水仙新品種選育的親本資源，需要從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及分子生物學(xué)等方面加以評價.本試驗(yàn)選取5種國外引進(jìn)的水仙進(jìn)行了染色體數(shù)目和核型分析，旨在明確其分類地位，并對其在育種上的利用提供指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為‘舒雅’(‘Replete’)、‘小燕子’(‘Swallow’)、‘普韋布洛’(‘Pueblo’)、‘胡德山’(‘Mount Hood’)、‘溫斯特丘吉爾’(‘Sir Winston Churchill’)等5個品種，種球均來源于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所.

1.2 方法

1.2.1 根系誘導(dǎo) 2017年11月底，選取健康的水仙鱗莖，每個品種選取5～8個，剝?nèi)ネ鈱雍稚善つ?，去除鱗莖盤下的枯根和包泥，洗凈后放置于玻璃瓶中水培，每天更換1次清水，經(jīng)3～5 d待根長1 cm左右時取用.

1.2.2 染色體標(biāo)本的制備 參考陳曉靜[11]的方法并經(jīng)優(yōu)化后的方案.待根長達(dá)到1 cm左右時，于中午11:00—12:00切取根尖，室溫下用0.2%秋水仙素預(yù)處理4 h以上，然后轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中固定24 h，在70%乙醇中保存?zhèn)溆?制片前，用蒸餾水洗凈根尖，轉(zhuǎn)入1 mol·L-1鹽酸，于60 ℃水浴解離15 min，用蒸餾水漂洗數(shù)遍后，切取1～2 mm根尖置于載玻片上，用丙酸—水合氯醛—鐵礬—蘇木精染色并將其搗碎，蓋上蓋玻片壓片.

1.2.3 核型分析 制備好的樣片用Nikon E200生物顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照.每個品種選取30個染色體清晰、分散良好的中期分裂相計數(shù)，選取10個最佳分裂相于400倍下攝影，各品種選取10張照片，按李懋學(xué)等[19]的核型標(biāo)準(zhǔn)分析，其中，核型不對稱系數(shù)(As·k)按Arano[20]的方法計算.

2 結(jié)果與分析

2.1 核型分析

2.1.1 ‘舒雅’的核型 體細(xì)胞染色體數(shù)2n=28，由于28條染色體根據(jù)大小和形態(tài)特征可以四四歸組匹配，推測該品種為x=7的同源四倍體.核型公式為：2n=4x=28=8m+16sm+4st，在本試驗(yàn)條件下未觀察到隨體染色體.染色體實(shí)際長度為5.54～13.11 μm，相對長度為8.29%～17.49%，最長染色體與最短染色體的比值為2.37，臂比(長臂/短臂)為1.40～3.62，臂比>2的染色體占46.43%，著絲粒指數(shù)為21.65%～42.43%，核型不對稱系數(shù)為67.85%，其核型屬于2B型(表1，圖1 A1、1 A2).

表1 5種水仙的體細(xì)胞染色體參數(shù)Table 1 Parameters of the chromosomes of five Narcissus cultivars

2.1.2 ‘小燕子’的核型 體細(xì)胞染色體數(shù)2n=30，根據(jù)染色體的大小和形態(tài)特征有20條可以兩兩匹配，另外10條為1個異源染色體組，推測該品種為x=10的異源三倍體.核型公式為：2n=3x=30=7m+17sm+5st+1t，在本試驗(yàn)條件下未觀察到隨體染色體.染色體實(shí)際長度為4.02～16.21 μm，相對長度為1.79%～8.99%，最長染色體與最短染色體的比值為4.03，臂比為1.28～10.74，臂比>2的染色體占40.00%，著絲粒指數(shù)為8.52%～44.72%，核型不對稱系數(shù)為66.49%，其核型屬于2C型(表1，圖1 B1、1B2).

2.1.3 ‘普韋布洛’的核型 體細(xì)胞染色體數(shù)2n=21，根據(jù)染色體的大小和形態(tài)特征有7對為同源染色體，另外7條為1個異源染色體組，推測該品種為x=7的異源三倍體.核型公式為：2n=3x=21=4m+13sm+4st，在本試驗(yàn)條件下未觀察到隨體染色體.染色體實(shí)際長度為5.74～17.08 μm，相對長度為2.51%～7.48%，最長染色體與最短染色體的比值為2.98，臂比為1.27～4.20，臂比>2的染色體占71.43%，著絲粒指數(shù)為19.21%～44.06%，核型不對稱系數(shù)為68.95%，其核型屬于3B型(表1，圖1 C1、1C2).

2.1.4 ‘胡德山’的核型 體細(xì)胞染色體數(shù)2n=28，根據(jù)染色體的大小和形態(tài)特征有21條可以三三歸組匹配，另外7條為1個異源染色體組，推測該品種為x=7的異源四倍體.核型公式為：2n=4x=28=8m+15sm+4st+1t，在本試驗(yàn)條件下未觀察到隨體染色體.染色體實(shí)際長度為3.47～16.91 μm，相對長度為1.08%～13.97%，最長染色體與最短染色體的比值為4.87，臂比為1.06～7.26，臂比>2的染色體占46.43%，著絲粒指數(shù)為12.10%～48.44%，核型不對稱系數(shù)為67.56%，其核型屬于2C型(表1，圖1 D1、1D2).

2.1.5 ‘溫斯特丘吉爾’的核型 體細(xì)胞染色體數(shù)2n=17，根據(jù)染色體數(shù)目可判定為染色體基數(shù)為x=10和x=7組成的異源二倍體.核型公式為：2n=2x=17=1m+9sm+7st(SAT)，在本試驗(yàn)條件下觀察到14號染色體上有隨體染色體(圖1 E1中紅色剪頭標(biāo)示).染色體實(shí)際長度為4.18～13.24 μm，相對長度為2.56～8.09，最長染色體與最短染色體的比值為3.12，臂比為1.35～5.50，臂比>2的染色體占76.47%，著絲粒指數(shù)為15.39%～42.57%，核型不對稱系數(shù)為73.30%，其核型屬于3B型(表1，圖1 E1、1E2).

2.2 核型比較

對5種水仙的核型進(jìn)行比較的結(jié)果(表1、圖1)表明：5種水仙材料的體細(xì)胞染色體數(shù)目為17～30條，最少的是‘溫斯特丘吉爾’，為17條，最多的是‘小燕子’，為30條；5種水仙中有二倍體材料1個，三倍體和四倍體各2個.根據(jù)核型公式，5種水仙體細(xì)胞中均含有中部著絲粒染色體(m)、近中部著絲粒染色體(sm)和近端部著絲粒染色體(st)3種，均以sm染色體為主.其中，‘小燕子’和‘胡德山’體細(xì)胞中各自有1條端部著絲粒染色體(t)，未發(fā)現(xiàn)正中部著絲粒染色體(M)和端粒染色體(T)；最長染色體與最短染色體的比值均大于2；臂比大于2的比率除‘普韋布洛’和‘溫斯特丘吉爾’高于50%外，其余3個品種均低于50%.核型不對稱系數(shù)由小到大排列為：‘小燕子’(66.49%、2C)、‘胡德山’(67.56%、2C)、‘舒雅’(67.85%、2B)、‘普韋布洛’(68.95%、3B)、‘溫斯特丘吉爾’(73.30%、3B).在本試驗(yàn)條件下，僅在‘溫斯特丘吉爾’發(fā)現(xiàn)了隨體染色體，其余4種均未發(fā)現(xiàn).

3 討論

水仙屬植物的親緣關(guān)系復(fù)雜，分類仍不夠完善，充實(shí)水仙細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的相關(guān)背景資料，為水仙的分類提供科學(xué)依據(jù)是很有必要的.本試驗(yàn)中，5種水仙均含有m、sm和st等3種染色體類型，僅‘小燕子’和‘胡德山’中含t染色體.‘舒雅’的核型為2B，在水仙屬植物中，該類核型報道甚少；‘小燕子’和‘胡德山’的核型為2C，與‘Ice Folliess’、‘Parisienne’[16]的核型相同；‘普韋布洛’和‘溫斯特丘吉爾’的核型為3B，與‘哈韋拉’、‘面對面’、‘快活’[14]、崇明水仙[15]和福建3個產(chǎn)地水仙[11]的核型相同.核型不對稱系數(shù)為66.49%～73.30%，最大的是‘溫斯特丘吉爾’，為73.30%.根據(jù)Stebbins[21]的進(jìn)化理論：核型不對稱系數(shù)越高，染色體變異越大，進(jìn)化程度越高，因此，‘溫斯特丘吉爾’在5種水仙中屬于相對比較進(jìn)化的類型.

形態(tài)學(xué)觀察顯示，‘小燕子’的花瓣和副冠均為黃色，每支花葶著生數(shù)朵小花，單瓣花，花粉敗育，不結(jié)籽，是x=10的異源三倍體，屬于多花水仙.‘舒雅’每支花葶著生1朵花，花朵大，重瓣類型，無花粉，不結(jié)籽，是x=7的同源四倍體，屬于洋水仙，推測該水仙是由2n=2x=14的二倍體通過染色體加倍獲得.‘普韋布洛’每支花葶著生1朵花，單瓣花，花粉敗育，不結(jié)籽，是x=7的異源三倍體，屬于洋水仙.‘胡德山’每支花葶著生1朵花，單瓣花，花粉敗育，不結(jié)籽，是x=7的異源四倍體，屬于洋水仙.‘溫斯特丘吉爾’部分花葶著生2～3朵花，重瓣類型，無花粉，不能結(jié)籽，是x=7和x=10組成的異源二倍體，屬于洋水仙，推測該水仙是由2n=2x=14的二倍體與2n=2x=20的二倍體雜交而來，可以通過染色體加倍獲得異源四倍體，此類型水仙的染色體數(shù)目與‘仙客來’水仙品種群‘Cyclataz’(2n=17)[22]相似，它們的親緣關(guān)系是否相近有待進(jìn)一步研究.

目前，國內(nèi)水仙花新品種選育多集中在多花水仙上，并取得了一定的成果，如‘云香’[23]、‘黃花2號’[24]、‘金玉’[25]等多花水仙新品種，但對洋水仙的研究相對較少，能否利用洋水仙的不同品種類型與現(xiàn)有的多花水仙進(jìn)行種間雜交，可作為今后一個有意義的探索.以上5種水仙的研究，既為水仙屬相關(guān)植物的分類和親緣關(guān)系研究提供一定參考，也為其在育種上的利用提供相應(yīng)的依據(jù).