陳路遙, 鄒小興, 丁 卉, 蘇超茹, 梁婷婷, 黃維2,

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心; 3.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

炎癥是機(jī)體對感染或組織損傷所產(chǎn)生的一種防御反應(yīng)[1].炎癥反應(yīng)過程包含機(jī)體和機(jī)體細(xì)胞的參與，伴隨一些化學(xué)物質(zhì)的釋放，這些化學(xué)物質(zhì)稱為炎癥因子或炎癥介質(zhì).脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)在革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中產(chǎn)生，是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分.LPS分子被嵌入外膜，分子的脂質(zhì)部分在細(xì)菌細(xì)胞壁中起到錨定脂多糖的作用.當(dāng)細(xì)菌進(jìn)行繁殖或死亡時才被釋放出來，其致炎性極強(qiáng)[2,3].

圓齒野鴉椿(EuscaphiskonishiiHayata)，又名福建野鴉椿[4]，為省沽油科野鴉椿屬常綠小喬木[5]，具有抗炎鎮(zhèn)痛，清熱解毒，消腫散結(jié)等功效[6,7]，是福建省民間傳統(tǒng)藥材.具有很強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛、清熱解毒、消腫散結(jié)等功效，在民間有良好的藥用基礎(chǔ)及悠久的藥用歷史.本研究通過提取圓齒野鴉椿果皮的總黃酮(TFEP)，并對TFEP進(jìn)行抗炎效果和作用機(jī)制研究，以期為圓齒野鴉椿資源的開發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)和0.01 mol·mL-1PBS溶液購自Hyclone公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、內(nèi)毒素脂多糖(LPS)購于北京索萊寶生物，PGE2、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物公司，地塞米松購自上海生工生物，蛋白含量檢測試劑盒購于凱基生物， NO檢測試劑盒均購于江蘇碧云天公司，二抗山羊抗兔IgG-HRP、二抗山羊抗鼠IgG-HRP，ECL化學(xué)發(fā)光顯色液，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購于北京全式金公司，二甲基亞砜(DMSO)及其余試劑均為分析純.一抗STAT3(signal transducers and activators of transcription3)、P-STAT3(磷酸化信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3)、NF-κβ(nuclear factor-kappa β)、P-NF-κβ(磷酸化的核因子κβ)和β-actin(β-non-muscle)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)均購于Santa Cruz公司.PCR引物序列如下.

表1 引物列表Table 1 List of primers used in PCR amplification

1.1.2 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海龍躍WJ-3D)、倒置生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器BDS 300PH)、立式高壓滅菌鍋(LDZX-75KBS上海申安)、微孔板檢測系統(tǒng)(酶標(biāo)儀Bio-Rad16166)、熒光定量PCR儀(Thermo Scientific PIKOREAL 96)、熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(SYNGENEG, BOX×74).

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng) DMEM 高糖培養(yǎng)基(10% 胎牛血清、1%雙青鏈雙抗)培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，并放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn).

1.2 方法

1.2.1 藥品提取 稱取圓齒野鴉椿果皮粗粉1.5 kg，用60%的乙醇(液料比1∶20)，加熱70 ℃回流提取3 h 2次，過濾、減壓并回收乙醇.將圓齒野鴉椿的乙醇提取物上樣到聚酰胺柱后，用蒸餾水洗脫除去色素、水溶性蛋白、糖類等雜質(zhì)，再用50%的乙醇溶液洗脫，薄層色譜板進(jìn)行檢測至出現(xiàn)黃酮時，逐步增加乙醇含量洗脫至無黃酮出現(xiàn)為止，收集洗脫液、減壓濃縮、干燥后得到果皮總黃酮.

1.2.2 MTT法細(xì)胞增殖毒性試驗(yàn) 在96孔培養(yǎng)板上以5×104個·mL-1接種細(xì)胞，每孔180 μL，試驗(yàn)組分別加入不同濃度的TFEP(50、100、200 μg·mL-1)或溶劑DMSO，每組設(shè)8個平行孔，37 ℃培養(yǎng)24 h，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，加入150 μL DMSO溶解，在570 nm波長下測吸光度值，根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞生長抑制率.細(xì)胞生長抑制率/%=(D對照-D試驗(yàn))/(D對照-D空白)×100%.

1.2.3 NO含量檢測 RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為 2×105個·mL-1， 每孔180 μL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜.設(shè)對照組(無LPS)和模型組(1 μg·mL-1LPS)，每個處理設(shè)5個復(fù)孔，試驗(yàn)組按50、100、200 μg·mL-1的藥物濃度給藥，給藥2 h后，模型組和試驗(yàn)組每孔加20 μL相應(yīng)濃度的LPS，對照組每孔加20 μL的含血清培養(yǎng)基，22 h后，利用NO試劑盒檢測上清NO分泌情況.

1.2.4 ELISA測定PGE2、IL-6及TNF-α蛋白表達(dá) 設(shè)正常組、模型組、試驗(yàn)組(LPS+50、LPS+100、LPS+200 μg·mL-1劑量組)和地塞米松陽性對照組(200 μg·mL-1)，將RAW264.7細(xì)胞按2×106個·mL-1接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶(5 mL)中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；24 h后去掉舊培養(yǎng)基，用PBS清洗2～3遍并吸凈，用無血清培養(yǎng)基將藥物母液稀釋到所需濃度，每瓶加5 mL；給藥后2 h，模型組、試驗(yàn)組和陽性對照組加入終濃度為1 μg·mL-1的LPS(500 μL)，正常組加入等體積無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20 h，取上清直接進(jìn)行ELISA檢測.

1.2.5 RT-PCR檢測mRNA水平 RAW264.7細(xì)胞懸液接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為 5×105個·mL-1，每孔3 mL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后加入TFEP(50、100、200 μg·mL-1) ，2 h后，試驗(yàn)組和模型組加入1 μg·mL-1LPS各20 μL，設(shè)為正常組、LPS組、LPS+TFEP組，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按Trizol試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后擴(kuò)增為DNA.擴(kuò)增條件為：42 ℃孵育15 min；85 ℃加熱5 s失活.溶解曲線擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，97 ℃ 0 s，0.11 ℃·s-1,1 cycle.熒光定量PCR儀檢測mRNA表達(dá)情況.

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá) RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度為5×105個·mL-1，每 孔5 mL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后同時加入TFEP(50、100和200 μg·mL-1)，2 h后試驗(yàn)組和模型組加入1 μg·mL-1LPS，設(shè)為正常組、LPS組、LPS+TFEP組，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量法檢測各組細(xì)胞蛋白濃度，煮沸滅活蛋白10 min，SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜，37 ℃下用封閉液封閉2 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗脫一抗，與二抗37 ℃下孵育1 h，ECL顯色，放入成像儀曝光，保存圖片.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±SD表示，應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.組間比較采用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 TFEP成分

在Waters W 2690/5-W 2998系統(tǒng)上，采用Dikma Dionsil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，30 ℃，使用Waters 2998 PDA檢測器和ACQUITY QDA質(zhì)譜檢測器，確定了圓齒野鴉椿主要黃酮類化合物為蘆丁、異鼠李素、山奈酚、槲皮素、夏佛托苷等.

2.2 TFEP對細(xì)胞NO分泌的影響

表2 圓齒野鴉椿果皮提取物對NO的影響Table 2 Effect of TFEP on NO production

1)與空白組比較，##P<0.01；與LPS模型組比較，*P<0.05，**P<0.01.

采用NO檢測試劑盒分析TFEP對LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響.結(jié)果如表2所示，與空白組相比，模型組給予1 μg·mL-1LPS刺激22 h后，NO分泌顯著增加(P<0.01) .采用50、100和200 μg·mL-1TFEP作用于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞，藥物組中NO的分泌則受到明顯抑制，并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系(P<0.05或P<0.01)，TFEP對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7產(chǎn)生NO的半數(shù)抑制濃度IC50為78.47 μg·mL-1.同時，采用MTT分析50、100和200 μg·mL-1TFEP的細(xì)胞毒作用，結(jié)果表明，RAW264.7細(xì)胞存活率均在90%以上，說明TFEP的抗炎活性與細(xì)胞毒性無關(guān).

2.3 TFEP對PGE2、IL-6及TNF-α蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較(表3)，RAW264.7細(xì)胞在受到LPS刺激后，細(xì)胞上清液中TNF-α、PGE2和IL-6釋放量顯著增加(P<0.01).與LPS模型組相比，TFEP各劑量組對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TNF-α、PGE2和IL-6釋放量均有顯著抑制作用(P<0.01)，且呈劑量依賴關(guān)系.與LPS模型組比較，地塞米松陽性對照組對TNF-α、PGE2和IL-6釋放量具有顯著抑制作用(P<0.01)；與TFEP各劑量組比較，當(dāng)藥物濃度均為200 μg·mL-1時，地塞米松陽性對照組對IL-6釋放量的抑制作用低于TFEP劑量組，但兩者差異不顯著(P>0.05).

2.4 TFEP對IL-6、iNOS及TNF-α mRNA表達(dá)的影響

RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)1 μg·mL-1LPS刺激后，與正常對照組比較，如圖1所示，在未受到刺激的狀態(tài)下，IL-6、iNOS和TNF-α的mRNA少量表達(dá)，LPS處理后，IL-6、iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.01).試驗(yàn)組隨著TFEP給藥劑量的增加，iIL-6、iNOS和TNF-α mRNA的表達(dá)量呈降低趨勢，200 μg·mL-1劑量下達(dá)到最小值，且此時與陽性對照藥地塞米松的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明TFEP藥物在200 μg·mL-1劑量時抑制IL-6、iNOS和TNF-α mRNA表達(dá)的作用效果與地塞米松相當(dāng)(P>0.05).

表3 TFEP對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α、PGE2和IL-6的影響Table 3 Effect of TFEP on the contents of TNF-α, PGE2和IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells

1)與空白組比較，#P<0.01；與LPS模型組比較，*P<0.05，**P<0.01.

2.5 TFEP對NF-κβ/Stat3信號通路蛋白表達(dá)量的影響

NF-κβ(nuclear factor-kappa β)信號通路能通過轉(zhuǎn)錄激活多種炎癥相關(guān)基因，JAK1(janus kinase 1)/Stat3(signal transducers and activators of transcription 3)信號通路活化能引起炎癥反應(yīng)，又能刺激NF-κβ的過度活化.如圖2Western blot結(jié)果顯示，NF-κβ和Stat3蛋白在各組RAW264.7細(xì)胞中條帶粗細(xì)變化并不明顯，P-NF-κβ和P-Stat3蛋白被LPS刺激后，模型組蛋白條帶相對變粗，顏色加深.經(jīng)TFEP各劑量給藥處理后，與模型組相比較， P-NF-κβ和P-Stat3蛋白條帶隨給藥濃度提高而逐漸變細(xì)，顏色逐漸變淺.

如圖3所示，NF-κβ和Stat3蛋白在各組RAW264.7細(xì)胞中表達(dá)量未見明顯變化，在被LPS刺激后，模型組細(xì)胞中P-NF-κβ和P-Stat3蛋白表達(dá)增加(P<0.01).經(jīng)TFEP各劑量給藥處理后，與模型組相比較， P-NF-κβ和P-Stat3表達(dá)量均顯著降低，且呈明顯的量效關(guān)系(P<0.05或P<0.01).

3 討論

近年來的研究結(jié)果表明，圓齒野鴉椿具有很好的抗炎作用和效果.炎癥是機(jī)體對外來病菌、有害刺激或物理損害等引起的一種組織學(xué)適應(yīng)性反應(yīng)，是許多疾病共有的基本病理過程[8].過度的炎癥反應(yīng)的防御機(jī)制會有所失調(diào)，甚至?xí)葑兂陕曰虺志眯约膊9].在炎癥發(fā)生過程中，巨噬細(xì)胞扮演著極為重要的角色，巨噬細(xì)胞能夠被LPS刺激所激活.LPS經(jīng)細(xì)菌釋放，通過TLR4受體介導(dǎo)[10]，使得炎癥信號通路被激活，從而誘導(dǎo)大量炎癥因子的合成與釋放，如NO、PGE2等炎癥介質(zhì)以及TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子，隨后機(jī)體會出現(xiàn)一連串的炎癥反應(yīng).因此，LPS作為誘導(dǎo)劑激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)常常用來評價藥物的抗炎活性情況.

本研究通過圓齒野鴉椿果皮提取物對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7相關(guān)炎癥細(xì)胞因子以及對炎癥相關(guān)通路的影響，進(jìn)一步研究圓齒野鴉椿的抗炎效果及作用機(jī)制.細(xì)胞因子被認(rèn)為是炎性應(yīng)答中重要的引發(fā)因子，炎癥相關(guān)疾病的特征是炎癥因子的過量表達(dá)[11].TNF-α和IL-6均為常見的促炎細(xì)胞因子，一般情況下表達(dá)量較低，當(dāng)炎癥發(fā)生時，它們的表達(dá)水平會顯著升高.TNF-α是一種主要由單核—巨噬細(xì)胞分泌的前炎癥細(xì)胞因子，過量的TNF-α?xí)又匮装Y損傷和誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的生成[12]，它能刺激單核—巨噬細(xì)胞合成IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子及TNF-α本身，能參與和調(diào)控多條炎癥相關(guān)通路的開放與運(yùn)行[13,14].IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，當(dāng)IL-6的表達(dá)水平處于正常標(biāo)準(zhǔn)時能促進(jìn)B細(xì)胞分化并產(chǎn)生免疫球蛋白、促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞成熟[15]，一旦分泌過量則會導(dǎo)致一系列的炎性損傷.因此，減少TNF-α和IL-6的過度產(chǎn)生可很好的控制炎癥反應(yīng)，緩解機(jī)體因炎癥反應(yīng)而引起的組織損傷，具廣闊的臨床應(yīng)用前景.

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成成分之一，具有極強(qiáng)的致炎性.LPS觸發(fā)炎癥反應(yīng)中包含一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，NF-κβ信號途徑在其中起中心作用.靜息狀態(tài)下NF-κβ與其天然抑制蛋白IκBs(inhibitor of NF-κβ)結(jié)合，但在促炎因素的刺激下，IκBs發(fā)生磷酸化而失活，釋放出游離的NF-κβ，隨之NF-κβ被磷酸化激活，并核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核啟動下游靶基因(如COX-2、iNOS、TNF-α等促炎介質(zhì))的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[16].酪氨酸激酶JAK(janus kinase)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化因子Stats(signal transducers and activators of transcription)是重要的細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在炎癥、腫瘤等多種疾病中有重要的調(diào)節(jié)作用[17].在正常生理?xiàng)l件下，Stat3的激活受到嚴(yán)格的調(diào)控，在炎癥等條件刺激下，Stat3可被磷酸化而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子(如NO和IL-6等)的表達(dá)[18].因此,目前NF-κβ/Stat3信號途徑在研究炎癥相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控中具有重要的指導(dǎo)意義.

基于上述理論，通過檢測TFEP對LPS刺激后，RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的NO分泌、炎癥相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)TFEP可劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生NO的分泌(表2)，下調(diào)TNF-α、PGE2和IL-6蛋白的表達(dá)(表3)，降低 TNF-α、iNOS和IL-6 mRNA水平(圖1)，ELISA與qRT-PCR兩者結(jié)果相一致.TFEP是通過在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6 mRNA，影響TNF-α和IL-6的分泌以達(dá)到抗炎作用.同時發(fā)現(xiàn)，NF-κβ/Stat3信號通路中，P-NF-κβ和P-Stat3在受到LPS刺激后，其表達(dá)量顯著上調(diào)，而TFEP給藥后，其表達(dá)量隨給藥劑量的增加而顯著下調(diào)，說明TFEP可抑制NF-κβ/Stat3的激活，從而抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng).這為TFEP抗炎作用的機(jī)制提供了體外試驗(yàn)證據(jù)，為下一步的體內(nèi)抗炎動物模型驗(yàn)證提供了依據(jù).