梁茜 李煒杰 楊希立 王蔚 田平閣

心肌缺血是心肌細胞氧供需失衡的結果。盡早進行血運重建是減少心肌缺血后損傷最有效的方法,但是會伴隨出現(xiàn)心肌缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/R 損傷)。I/R 損傷通過鈣超載、細胞凋亡、線粒體損傷、氧自由基生成增加、自噬等機制發(fā)揮作用［1］。其中,越多越多的研究表明自噬在I/R 損傷和恢復中起著重要的作用。復方丹參滴丸為現(xiàn)代中藥制劑,具有理氣止痛、活血化瘀功效。近年來關于丹參滴丸抗I/R 損傷的研究逐漸增多,是首個通過美國食品藥品管理局(FDA)Ⅲ期臨床試驗的中成藥。其作用機制也日益受到國內(nèi)外研究人員的關注。本文主要通過回顧I/R 損傷的機制以及復方丹參滴丸在冠心病尤其是I/R損傷治療中的分子機制調節(jié)作用做文獻綜述。

1 I/R 損傷影響以及機制

1.1 I/R 損傷的影響 I/R 損傷主要體現(xiàn)為以下4 種臨床表現(xiàn)。①再灌注性心律失常,多發(fā)生在再灌注開始時,常出現(xiàn)加速性室性自主心律、實行心動過速、室顫等現(xiàn)象,但多為一過性的。②心肌頓抑,心肌恢復灌注后處于可逆性心肌收縮功能失調,持續(xù)數(shù)小時、數(shù)天甚至數(shù)周。③血液無復流,缺血心肌在冠脈閉塞或狹窄解除后仍未能恢復有效再灌注,微循環(huán)血流仍未完全恢復正常的現(xiàn)象。Eeckhout 等［2］根據(jù)無復流的特征將其分為3 類：①實驗性無復流；②心肌梗死再灌注無復流；③血管造影無復流：常規(guī)經(jīng)皮冠狀動脈介入(percutaneouscoronary intervention,PCI)過程中產(chǎn)生的無復流;④微循環(huán)障礙,I/R 會引發(fā)內(nèi)皮細胞功能失調進、破壞血管內(nèi)皮結構進而阻礙了微血管內(nèi)血液循環(huán)。同時,I/R 極易引起微動脈粥樣斑塊破裂、形成微血栓,進一步加重心肌缺血［3］。

1.2 I/R 損傷的機制 I/R 的發(fā)生機制主要有以下幾點。

1.2.1 產(chǎn)生過多的氧自由基(OFR) OFR 是機體內(nèi)氧分子還原的中間產(chǎn)物。生理狀態(tài)下,OFR 可被過氧化氫酶、超氧化物歧化酶(SOD)多種酶清除,減少其對細胞的損傷。當心肌發(fā)生I/R 時,OFR 氧化心肌細胞膜中的不飽和脂肪酸,生成脂質過氧化物(LPO)。生物膜脂質過氧化后,可引起細胞膜功能和結構的障礙、膜磷脂成分改變、通透性增加,最終造成心肌細胞功能和結構的損傷。

1.2.2 鈣超載 在心肌缺血缺氧的過程中,細胞內(nèi)的糖酵解逐漸增強,引起乳酸堆積,最后導致心肌細胞酸中毒?；謴托募⊙\重建后,乳酸等代謝產(chǎn)物隨血液流走,細胞外pH 值升高,使細胞膜上Na-H 離子交換增加,而Na+濃度升高激活Na-Ca 離子交換,使心肌細胞鈣離子超載,引起細胞膜結構的損傷［3］。在心肌I/R 過程中,鈣超載和OFR 過度生成相互促進,形成惡性循環(huán),加重心肌損傷。同時引起心肌細胞膜電位異常,誘發(fā)惡性心律失常等。

1.2.3 心肌細胞凋亡 I/R 后,由于細胞內(nèi)OFR 增多和Ca2+超載,細胞核內(nèi)凋亡基因Bcl-2/bax、抑癌基因P53、Bcl-xL、Fas/Fas-L、腫瘤壞死因子高表達,心肌細胞會啟動凋亡程序。劉艷霞等［4］通過建立心肌缺血再灌注大鼠模型,應用缺口末端標記法檢測心肌細胞凋亡情況,結果顯示,缺血再灌注組的細胞凋亡率顯著升高,同時凋亡調控基因Bcl-2、Bax 蛋白表達量顯著升高,這表明細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷的過程中起到了關鍵作用。

1.2.4 細胞自噬 多年來,人們對致死性的I/R 損傷的治療著力于如何減輕損傷所引起的細胞壞死和Ⅰ型程序性細胞死亡上。然而隨著對自噬(Ⅱ型程序性細胞死亡)研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)這一細胞內(nèi)能量、物質的自我代謝過程在對抗心肌缺血再灌注損傷及梗死后心臟重構和恢復上起著重要作用,為人們治療缺血再灌注損傷提供了新的治療靶點。自噬的過程大致可分為4 個階段。第一階段：在饑餓等應激狀體下,Ⅲ型磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)被激活,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)受到抑制,誘導自噬發(fā)生。第二階段：PI3K 和Beclin1 等自噬相關基因(Atg)蛋白結合組裝,并不斷延長,包裹降解物質形成自噬體。此時電鏡下可觀察到獨特的雙層膜結構小體,因此通過檢測和評估小體的數(shù)量可作為評估自噬活性的金標準［5］,而Beclin 1 成為自噬增加的重要標志之一［6,7］。另一方面Atg8,也稱為微管相關蛋白輕鏈3 (microtubuleassociated protein light chain 3,LC3),被水解激活成胞質可溶性的LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ,其與其他Atg 蛋白錨定在自噬體膜上,是促進自噬體延長及成熟的關鍵元素。因此通過熒光標記細胞內(nèi)LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的含量可以看作是自噬發(fā)生的依據(jù)［8］。第三階段：自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體。第四階段：自噬溶酶體內(nèi)的物質被降解并被機體再利用。P62 同樣是自噬過程中重要的標記蛋白。它作為連接LC3 和泛素化物質的紐帶,并入成熟的自噬體中,并被自噬溶酶體降解。它能很好的反映細胞內(nèi)被降解物的清除程度。P62 含量的升高意味著細胞內(nèi)降解物的清除不足,自噬過程受到抑制,有研究發(fā)現(xiàn)其與自噬程度有良好的負相關性［9,10］。Matsui 等［11］結扎大鼠冠狀動脈20 min 后發(fā)現(xiàn),在缺血心肌部分用免疫熒光標測LC3-Ⅱ,其含量明顯大于非缺血心肌部分。在其他離體心肌細胞及動物模型實驗上,通過電鏡及免疫標測LC3-Ⅱ同樣也觀察到自噬的上調［12］。雖然有部分學者提出了不同的聲音,認為自噬的上調對心肌的作用依賴于缺血的程度、持續(xù)時間,甚至還與受損的細胞類型及缺血部位密切相關。在一些實驗中,研究者發(fā)現(xiàn)自噬的過度表達不利于心肌細胞的存活、細胞凋亡的抑制以及梗死面積的控制［13］。

2 復方丹參滴丸概況

復方丹參滴丸是一種采用現(xiàn)代藥學制劑技術研制的純中藥滴丸劑,主要含有丹參素、丹參酮ⅡA、三七、皂苷等有效成分。丹參,味苦微寒,有涼血消腫、養(yǎng)血安神的功效。三七,味苦甘,性溫,有止血止痛、活血化瘀作用。冰片為化學合成物,可引導其他藥物進入靶點以發(fā)揮藥效,具有開竅醒神、清熱止痛的作用［14］。研究表明,復方丹參滴丸中以丹參素為主的水溶性成分具有抗血小板聚集,擴張冠狀動脈,保護心肌缺血作用。而以丹參酮ⅡA 為主的脂溶性成分可明顯減少心肌梗死面積,刺激血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生NO 并且能抑制血管緊張素Ⅱ引起的內(nèi)皮細胞增生［15］。皂苷類成分具有改善血流動力學,保護內(nèi)皮細胞,抗血栓形成等功能［16］。在已完成的美國FDA Ⅲ期實驗中,復方丹參滴丸能顯著提高最大運動耐受時間和減少心絞痛發(fā)作次數(shù)(T89-07-CAESA,http://clinicaltrials.gov/)。

3 復方丹參滴丸用于I/R 損傷治療的分子機制

3.1 抗氧化作用 趙倩等［17］通過構建心肌缺血再灌注 SD 大鼠模型,再灌注結束后檢測血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)的活力,并采用“伊文氏藍-TTC”法測量計算心肌梗死面積,發(fā)現(xiàn)復方丹參滴丸和缺血后處理均可以減少心肌梗死面積,減少血清CK、LDH 的釋放(P＜0.05)。心肌缺血時會發(fā)生有氧代謝障礙,細胞內(nèi)乳酸堆積,細胞內(nèi)酸中毒,使心肌出現(xiàn)興奮-收縮耦聯(lián)障礙,心肌收縮力減弱、心室功能降低［18］。徐曼等［19］在細胞水平的研究中發(fā)現(xiàn),復方丹參滴丸可以下調 Fas 基因及其配 體 FasL 蛋白表達,減少凋亡,從而減輕缺氧造成的損傷。核因子NF-E2相關因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是重要的抗氧化蛋白,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/AKT)信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路［20］。而研究表明復方丹參滴丸可激活 PI3K/AKT 通路誘導AKT 磷酸化,上調Nrf2 表達,從而啟動內(nèi)源性抗氧化反應,抑制氧化應激損傷。

3.2 抗鈣超載作用和清除自由基 細胞內(nèi)Ca2+是造成心肌細胞損傷的重要因素,且其濃度和細胞受損程度密切相關［21］。藥理學研究證實,復方丹參滴丸中的丹參酮可抑制動脈平滑肌細胞電壓依賴性鈣通道及受體門控型鈣通道,發(fā)揮擴血管效應［22］。三七中的人參皂苷能抑制細胞外鈣離子內(nèi)流和釋放,非選擇性地抑制鈣離子激動所致的心肌收縮,防止鈣超載［23］；此外,冰片可通過擴張冠狀動脈增加冠脈血流量,緩解心肌缺血［24］。冠心病患者心肌組織缺血缺氧,OFR 生成增多,導致血漿中LPO 增高。采用丹參治療后,LPO明顯降低,提示丹參對于外源性OFR 能起到良好的清除作用。此外,丹參中主要含有丹參素、維生素E 和硒。其中丹參素可明顯增強SOD 和谷胱甘肽過氧化物(GSH-Px)活性,維生素E 是有效的抗氧化劑,硒是GSH-Px 的重要組成成分且可加強維生素E 的抗氧化作用。另外,復方組分中的三七皂苷也具有一定的抗氧化能力進而保護組織細胞［25］。

3.3 調控細胞自噬 自噬是一個高度保守的細胞自我代謝過程,在機體處于饑餓、能量缺乏及代謝應激時將衰老、損傷的細胞器或錯誤折疊的蛋白轉運至溶酶體進行降解,再將降解物供機體利用,維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［5］。當心肌在一定程度的缺血再灌注的條件下,心肌細胞能量缺乏,Ca2+超載,活性氧自由基增多,觸發(fā)自噬的發(fā)生［26］。目前大部分的研究表明自噬的上調和細胞膜的完整、線粒體膜電位的穩(wěn)定、延遲不可逆細胞損傷的啟動等密切相關,同時自噬的上調可清除受損的細胞器,為心肌細胞提供代謝所需的能量和物質,減輕缺血再灌注對心肌的損傷。實驗證明,經(jīng)缺血再灌注處理后的大鼠心肌細胞因自噬的缺失會導致心肌病變［13,27］。而通過敲除抑制自噬的相關基因后發(fā)現(xiàn),自噬的增強能夠減輕缺血再灌注大鼠心肌細胞的凋亡,同時很好的改善遠期心臟的重構［27］。在Ca2+誘發(fā)心肌細胞自噬方面,有文獻報道鈣再灌注期線粒體的Ca2+超載可誘導心肌細胞的自噬活性,加重心肌細胞的損傷。而復方丹參滴丸中的丹參素有阻滯Ca2+通道、三七總皂苷有拮抗Ca2+的作用,由此推測復方丹參滴丸有可能通過降低心肌細胞內(nèi)的Ca2+含量來影響自噬作用。此外還有學者發(fā)現(xiàn)一些炎癥因子對自噬也有調控作用,如 白細胞介素6(IL-6)的過度表達會通過支持人支氣管上皮細胞中的Beclin1 和抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1 之間的相互作用阻礙自噬的發(fā)生［28］。而實驗表明,復方丹參滴丸能有效地降低急性心肌梗死患者血清 IL-6 水平,抑制炎癥反應［29］,由此認為復方丹參滴丸可能通過調節(jié)炎癥因子來影響心肌自噬作用,從而改善心肌缺血再灌注損傷。王學莉等［30］觀察復方丹參滴丸對 I/ R 模型大鼠的心肌細胞內(nèi)游離鈣濃度、SOD 和丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量影響試驗中發(fā)現(xiàn),復方丹參滴丸在整體和細胞水平均能降低 MRI 大鼠復氧復糖心肌細胞內(nèi)游離鈣熒光強度、提高SOD 活性(P＜0.01)、減少 MDA 生成,并適當增加 NO 含量(P＜0.01)。說明復方丹參滴丸既保護內(nèi)源性SOD 活力,又能減輕心肌細胞膜LPO 的損傷,從而增強了心肌細胞的抗OFR 損傷能力,保持心肌細胞膜結構的完整性,避免了心肌細胞內(nèi)Ca2+超載及減少心肌細胞不可逆性損傷。

4 小結

復方丹參滴丸是根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學技術和中醫(yī)傳統(tǒng)理論研制而成的一種中藥滴丸劑,是首個通過美國FDAⅢ期臨床試驗的中成藥。目前復方丹參滴丸用于冠心病尤其是I/R 損傷治療的分子機制尚未完全清楚,涉及多種炎癥因子、轉錄因子、細胞因子、凋亡相關蛋白、生長因子以及生物酶等多種生物因子的調控,間接說明復方丹參滴丸是通過多靶點作用起到改善心肌缺血再灌注損傷的作用。相信隨著更多越來越深入的基礎研究及高質量、大規(guī)模的臨床研究的開展,復方丹參滴丸對于I/R 的作用機制將不斷完善。