硫酸多糖類藥物含量測定方法研究進展

葉靜 馬長宏

硫酸多糖類藥物主要包括巖藻聚糖硫酸酯、肝素、甘糖酯以及硫酸軟骨素等等。目前也有較多研究［1,2］證實硫酸多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗凝血以及抗病毒等多種生物活性。同時張璐欣等［2］指出,生物活性和硫酸化程度有著密切的關(guān)系。而多糖作為一種藥物,它的含量高低會給藥效帶來直接影響。加之多糖藥物結(jié)構(gòu)存在不均一性,因此不同的藥物含量測定方法,其測定含量的結(jié)果也不一樣［3］。本文主要針對目前國內(nèi)外的硫酸多糖類藥物結(jié)構(gòu)組成、來源以及相關(guān)含量的測定方法進行針對性的分析總結(jié),概述硫酸多糖類藥物含量測定方法近幾年的發(fā)展趨勢,以望為后期硫酸多糖類藥物含量測定帶來一定的參考依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 硫酸多糖類藥物的來源

1.1肝素 豬的腸黏膜或是牛的腸黏膜是肝素的主要來源,肝素屬于天然黏多糖之一,由70%～90%的2-硫酸艾杜糖醛酸以及N-硫酸-6-硫酸-氨基葡萄糖,加上10%～30%的N-硫酸氨基葡萄糖以及10%～20%的葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸組成［3］。

1.2硫酸軟骨素 豬氣管以及豬喉骨等軟組織是硫酸軟骨素的主要來源,其為天然黏多糖之一,是由D-葡萄糖醛酸以及N-乙酰半乳糖胺組成的共聚物［4］,目前常見的天然的硫酸軟骨素有硫酸軟骨素A、B、C等。

1.3甘糖酯 甘糖酯是以藻酸雙酯鈉合成作為基礎(chǔ),將褐藻膠進行一系列的降解以及分級純化后所得的產(chǎn)物PM當(dāng)作原料,之后再通過化學(xué)合成的方法獲得半合成硫酸多糖。

1.4巖藻聚糖硫酸酯 巖藻聚糖硫酸酯的來源主要通過提取海帶中的水溶性雜多糖,它是腎?？抵谐Ｒ姷囊环N主要成分,而腎?？凳悄壳芭R床上治療慢性腎衰竭中常見的一種海洋藥物［4］。

2 硫酸多糖類藥物含量測定方法

2.1直接染色法 直接染色法是目前常見的硫酸多糖類藥物含量測定方法之一,由于硫酸多糖類藥物中的羧基以及硫酸基都帶有負荷,因此能夠和帶有正電荷的陽離子染料結(jié)合,致使吸光度發(fā)生一定程度的變化,根據(jù)其變化能夠測定其含量［5］。直接染色法目前常見的有結(jié)晶紫染色法、二甲美蘭染色法以及維多利亞藍B染色法等。但是需要注意的是,由于陽離子染料種類以及乳化劑的種類都比較多,而不同種類的反應(yīng)條件也不同,因此在進行測定的時候,還需要根據(jù)實際需要來選擇適合的陽離子染料以及乳化劑。

2.2酸降解-顯色法 酸降解-顯色法也是常用的測定方法之一,該測定方法將多糖聚合物的結(jié)構(gòu)作為途徑入手,在酸性條件的環(huán)境下,將多糖聚合物轉(zhuǎn)化為寡糖單元或者是轉(zhuǎn)化為單糖以便進行測定。其中單糖、寡糖以及糖醛酸等是當(dāng)下常見的多糖聚合物結(jié)構(gòu)單元對象,而Elson-Morgan法、間苯三酚法以及咔唑法是目前比較常見的三種測定方法。

2.2.1Elson-Morgan法 Elson-Morgan法可以說是在硫酸軟骨素含量測定中最早使用的一種測定方法,其測定原理主要是硫酸多糖降解產(chǎn)物可以在堿性條件下和乙酰丙酮進行相應(yīng)的縮合,它的產(chǎn)物可以在525 nm波長處發(fā)生紫外吸收,因此能夠以此測定其含量,但是也有較多研究指出［5,6］,該測定方法的操作步驟相對來說比較復(fù)雜,重現(xiàn)性比較差等。

2.2.2間苯三酚法 間苯三酚法屬于應(yīng)用比較普遍的一種多糖含量測定方法,其測定原理是在酸性條件下,將多糖降解成為單糖,之后再將單糖進一步分解為糠醛,它可和間苯三酚發(fā)生反應(yīng)顯色,同時能夠在490 nm波長處發(fā)生紫外吸收,因此能夠以此對多糖含量進行測定,間苯三酚法測定方法的操作相對比較簡單,同時測定時間比較短。賈東升等［6］曾經(jīng)分別采用間苯三酚法和Elson-Morgan法對硫酸軟骨素的含量進行了測定,結(jié)果顯示相比于Elson-Morgan法,間苯三酚法測定的含量要顯著更高。

2.2.3咔唑法 咔唑法一般主要用于測定藻酸雙酯鈉以及甘糖酯等多聚糖醛酸類的含量,其測定原理是在強酸作用下,糖醛酸可以生成含有羧基的糠醛,它能夠和咔唑發(fā)生反應(yīng)并且顯色,同時可以在530 nm波長處發(fā)生紫外吸收,因此能夠測定多糖含量。目前有研究指出［6］,咔唑法具有較高的測量準(zhǔn)確度,但是其不足之處為專屬性較差。有研究曾經(jīng)通過硫酸多糖類藥物的離子強度以及其pH值,之后再選擇氯化十六烷基吡啶選擇性沉淀硫酸軟骨素鈉,分離硫酸軟骨素鈉,再通過咔唑法一起將兩種多糖含量進行了測定,回收率理想。

2.3光度滴定法 硫酸多糖和氯化十六烷基吡啶,前者為酸性聚陰離子電解質(zhì),后者為含氮的陽離子表面活性劑,兩者相互作用可以生成沉淀,如果條件適宜,可以形成混懸液,將其和對照品溶液比較透光度可以對硫酸多糖含量進行測定。在歐洲以及美國藥典中,光度滴定法是測定硫酸軟骨素含量的法定方法,但其在具體操作方面以及規(guī)定方面存在一定差異,但原理相同。

2.4液相色譜法

2.4.1柱前衍生-高效液相色譜法(HPLC) 單糖不僅具有較強的極性,同時其結(jié)構(gòu)也比較相近,光學(xué)活性低,大部分衍生試劑大都基于還原胺化反應(yīng),其衍生期間反應(yīng)時間相對較長,同時其反應(yīng)衍生的產(chǎn)物也不是很穩(wěn)定,因此容易對下一步分析造成較大的影響。還原性糖可以和PMP在溫和條件下發(fā)生反應(yīng),同時不需要進行酸催化,可發(fā)生較強的紫外吸收,因此在單糖組成的研究中,有著廣泛的應(yīng)用［7］。

2.4.2柱后衍生-HPLC 有相關(guān)研究資料指出［7］,多種硫酸多糖的胍基類衍生物可存在熒光,用其進行糖類物質(zhì)的衍生分析,可收獲較高的分析準(zhǔn)確性,同時如果和高效液相色譜法進行結(jié)合,還可對硫酸多糖類藥物含量做出快速有效的測定。汲晨鋒等［8］曾經(jīng)將鹽酸胍選擇作為研究中的衍生試劑,通過熒光檢測器對聚甘古酯的血藥濃度進行了測定。

2.4.3離子色譜法 離子色譜法(IC)是在上世紀(jì)七十年代美國學(xué)者在離子交換色譜法的基礎(chǔ)上研究出來的一種液相色譜技術(shù),該技術(shù)將陰離子交換柱分離有關(guān)物質(zhì)進行檢測,在有機陰陽離子的檢測以及無機陰陽離子的檢測中得到成功且廣泛的應(yīng)用。除此之外,由于離子色譜法不需要衍生,且樣品前無需進行任何處理,能夠顯著降低人力物力的消耗,因此在近幾年的藥品檢測中得到迅速發(fā)展,特別是在糖檢測中,其發(fā)展尤為迅猛。曾經(jīng)有學(xué)者通過該方法不僅成功的分離了葡萄糖、麥芽糖以及核糖,同時還成功的測定出了葡萄糖、麥芽糖以及核糖的含量,進一步說明了在硫酸多糖含量測定中,離子色譜法的良好測定應(yīng)用價值。

2.5生物效價法 肝素質(zhì)量控制方法中,生物效價法是其法定控制方法,不僅在我國藥典中引用了生物效價法,在美國、日本以及英國的藥典中也引用了生物效價法。但是不同國家藥典中生物效價法的操作以及相關(guān)具體要求略有不同。硫酸多糖類藥物結(jié)構(gòu)和肝素比較相似,由此在硫酸多糖類藥物含量測定方法中,可以將肝素含量的測定方法作為參考即生物效價法。目前生物效價法主要有兩類,一類是血液凝固法,另一類則是微量生色底物法。

2.5.1血液凝固法 血液凝固法種類較多,例如兔全血法、APTT法以及羊血漿法等,其全部都是通過將血漿的凝結(jié)時間進行延長來表征肝素含量以及純度。

2.5.2微量生色底物法 此測定方法是通過對抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子活性進行測定后,以進一步分析肝素類藥物的生物效價,以揭示其含量,微量生色底物法具有較強的專屬性,除此之外,其檢驗的成本相對來說也比較低,因此目前已經(jīng)有較多的國家選擇將微量生色底物法作為肝素效價的測定方法。由于硫酸多糖類藥物的硫酸根分布有著比較明顯的規(guī)律性,因此能夠通過對硫酸根含量進行測定來間接揭示硫酸多糖類藥物含量,值得注意的是,此測定方法并不能夠?qū)Χ嗵堑膶嶋H含量做出有效表征。蔡超等［9］曾經(jīng)通過酸水解法對肝素予以有機破壞,之后再通過離子色譜法對硫酸根含量進行針對性的測定,待樣品溶解后,再對已經(jīng)游離的硫酸根含量作進一步測定,最后再通過計算得出樣品里面結(jié)合的硫酸根含量。

3 討論

目前在所有的硫酸多糖類藥物含量測定方法中,Elson-Morgan法、間苯三酚法、直接染色法以及咔唑法都是通過紫外分光光度計進行檢測,這幾種檢測法在儀器要求上相對而言會比較低,同時花費也比較少,但是不足之處在于其重現(xiàn)性不佳,檢測精密度不理想,因此會對檢測結(jié)果帶來較大影響。光度滴定法則是國外藥典中對硫酸軟骨素含量的一種法定檢測方法,但是由于硫酸軟骨素的水解產(chǎn)物為氨基半乳糖,不僅無法準(zhǔn)確測出硫酸軟骨素的真實含量,而且其結(jié)果的重現(xiàn)性也不理想。液相色譜法則是各國藥典中對硫酸多糖含量測定的一種主流測定方法,不僅具有較高的精密度,不易產(chǎn)生較大誤差,而且還可以在最大程度上反映出藥物的真實含量。而對于生物效價法,由于該測定方法只對具有肝素樣抗凝血作用的硫酸多糖比較適用,因此在實際應(yīng)用中存在較大的局限性?？傊?近幾年硫酸多糖類藥物因其特有的生物活性,受到了越來越多的學(xué)者的關(guān)注以及研究,而如何進一步提高硫酸多糖類藥物含量的測定效果依舊是未來幾年的研究重點之一。