環(huán)狀RNA與口腔鱗狀細胞癌研究進展

雷可昕 白賀天 楊淞月 李敬 陳謙明

1.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院，成都 610041；2.四川大學華西臨床醫(yī)學院，成都 610041

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是長鏈非編碼RNA（lncRNA）家族的一個新成員[1]。與線性RNA不同，這種RNA不具有5'甲基鳥苷帽和3'多聚腺苷酸尾的特征，而是一個共價的閉環(huán)結構，因此環(huán)狀RNA對核糖核酸酶（Rnases）不敏感，這使它與線性RNA相比具有更高的穩(wěn)定性[2]。根據不同的來源，環(huán)狀RNA可分為外顯子環(huán)狀RNA（exonic circRNA）[3]、內含子環(huán)狀RNA（intronic circRNA）[4]、外顯子-內含子環(huán)狀RNA（exon-intron circRNA）[5]，以及來源于tRNA的環(huán)狀RNA（TriRNA）[6]。研究[7]表明，環(huán)狀RNA廣泛地參與了各種疾病的發(fā)病，其復雜多樣的功能、獨特的豐富性、廣泛性、穩(wěn)定性以及組織特異性在病理過程中發(fā)揮了重要作用，成為生物學領域的明星分子。

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）在世界最高發(fā)癌癥中占到了第11位[8]。OSCC具有局部侵襲性、高復發(fā)性、易轉移等特點，5年生存率低于許多實體腫瘤，僅為50～60%[9]。然而目前對OSCC的分子機制尚不清楚，尚無高敏感度、高特異性的生物標記物作為OSCC早期診斷、治療與預后的監(jiān)測指標。已有文獻表明環(huán)狀RNA與OSCC的惡性進程有所關聯，提示著環(huán)狀RNA具有作為OSCC早期診斷和生物治療標志物的潛在功能。本文簡要介紹了環(huán)狀RNA的特性、生成過程，并從其生物學功能出發(fā)，討論了它們在腫瘤，尤其是OSCC中的研究進展。

1 環(huán)狀RNA的成環(huán)機制

在真核生物中，典型的剪接是由剪接體機制形成的，它去除內含子并將外顯子連接成一個線性RNA轉錄體[10]。大多數的環(huán)狀RNA來源于外顯子。整個過程可分為兩部分：1）一個或多個外顯子對的上游內含子與下游內含子連接；2）上游內含子的2'-羥基與下游內含子的5'-磷酸基團反應，然后3'-外顯子的3'-羥基與5'-外顯子的5'-磷酸反應，最終形成環(huán)狀RNA[11]。內含子中的ALU序列也可以相互作用，促進反向剪接[12]。一些RNA結合蛋白在這一過程中起到了調節(jié)因子的作用，例如RNA結合蛋白MBL連接近側內含子，促進了環(huán)狀RNA的產生[13]；而RNA編輯酶ADAR1抑制了環(huán)狀RNA的形成[14]。此外，套索驅動的環(huán)化是另一種產生環(huán)狀RNA的機制，上游剪接受體和下游供體由于RNA套索的存在而相互接近，而外顯子則由5'-3'磷酸二酯鍵連接[15]。

2 環(huán)狀RNA的生物學功能

環(huán)狀RNA作為非編碼RNA具有多樣的功能，主要分為以下5個方面。

2.1 miRNA的海綿作用

miRNA被認為是內源性非編碼RNA，它能抑制下游基因表達，進而抑制蛋白質合成。越來越多的研究[7]發(fā)現具有互補序列的環(huán)狀RNA可以海綿樣吸附miRNA，并抑制其下游基因表達。比如，cirs-7，又名CDR1as，是含有70個以上miR-7結合位點的環(huán)狀RNA[5,16]，它能夠和miR-7結合并作用于其下游的mRNA。此條分子通路軸在星形細胞瘤和肺癌等疾病中廣泛表達[17]。

2.2 調控線性RNA轉錄

環(huán)狀RNA可以促進或抑制線性RNA的轉錄，是選擇性剪接或轉錄的關鍵調節(jié)因子。由外顯子形成的環(huán)狀RNA占已知環(huán)狀RNA的絕大部分，它們的生成過程對傳統(tǒng)剪接有競爭性的影響[14]。

2.3 對蛋白質的海綿作用

環(huán)狀RNA也可以吸附RNA結合蛋白（RNA binding protein，RBPs）來調節(jié)蛋白質水平。例如在蒼蠅和人類身上發(fā)現的circ-MBL可以在多個結合位點與MBL蛋白結合[7]。

2.4 與蛋白質相互作用

越來越多的研究[18]表明，一些環(huán)狀RNA也能夠與蛋白質相互作用，從而影響細胞的行為。例如circFOXO3是目前受到最廣泛關注的一種環(huán)狀RNA，被證明是連接p21和細胞周期依賴性蛋白激酶2（cyclindependent kinases 2，CDK2）的一種適配器。circ-FOXO3促進CDK2從p21中釋放出來，p21可以磷酸化細胞周期素A和細胞周期素E，從而促進細胞分裂增殖。circFOXO3高表達還可促進p53與MDM2的相互作用，進而加速p53的降解[19]。

2.5 調控蛋白翻譯

雖然環(huán)狀RNA缺乏5'7-甲基鳥苷帽結構和3'多聚腺苷酸尾這兩種線性RNA翻譯的兩個基本特征，但環(huán)狀RNA也可以翻譯成脯氨酸或多肽。1995年初步研究[20]發(fā)現，腦心肌炎病毒核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）在人工環(huán)狀RNA的翻譯中起著重要作用。此外，Yang等[21]發(fā)現，RNA最豐富的修飾N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，M6A）促進了人細胞內環(huán)狀RNA的翻譯，提示環(huán)狀RNA來源的蛋白在外界影響下起著重要的作用。

3 環(huán)狀RNA與腫瘤

研究表明，環(huán)狀RNA在實體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，特別是通過其作為miRNA海綿的生物學功能。環(huán)狀RNA參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的幾個特征性進程，如逃避生長抑制因子、維持增殖信號、逃避細胞死亡和衰老以及具有促進血管生成、激活侵襲和轉移的能力。此外，腫瘤細胞內環(huán)狀RNA的異常表達、組織特異性、多樣性和穩(wěn)定性使其具有腫瘤標記物的巨大潛能。

在肝癌中，研究人員發(fā)現hsa_circ_0005075在60組肝癌組織中的表達與正常組織有顯著差異，表明hsa_circ_0005075是潛在的生物標志物[22]。此外hsa_circ_0001649的表達也存在差異，且與肝癌腫瘤大小和癌栓的發(fā)生密切相關[23]，而circZFR、circFUT8和circIPO11被證明可用于肝癌標本的鑒別[24]。對于肺癌，臨床隊列研究和細胞水平研究均發(fā)現circRNAITCH在肺癌中起抑制作用。circRNA-ITCH調控異常可通過對miR-7和miR-214的海綿作用增強其親本抑癌基因ITCH的表達，從而調節(jié)癌細胞的增殖[25]。circ-001569能海綿樣吸附miR-145并上調其下游基因如E2F5、BAG4和FMNl2的表達，導致G2/M期細胞增多，腫瘤細胞凋亡減少[26]。另外，在非實體腫瘤中，Salzman等[27]偶然發(fā)現在急性髓系白血病中產生了數百個環(huán)狀RNA的基因，而這些環(huán)狀RNA也同時在HeLa細胞中被檢測到。另外還有研究[28]證實了化療可抑制急性髓系白血病患者hsa_circ_0004277的異常表達。

除上述腫瘤外，也有研究發(fā)現有些環(huán)狀RNA與胃癌[29-31]、乳腺癌[32-33]、結腸癌[26,34]、膀胱癌[35]、卵巢腫瘤[36]、皮膚鱗狀上皮癌[37]等多種癌癥關系密切。

4 環(huán)狀RNA與OSCC

4.1 環(huán)狀RNA在OSCC中的研究現狀

高通量測序的應用讓越來越多OSCC特異性表達的環(huán)狀RNA被篩選出來。國內有研究通過環(huán)狀RNA芯片技術篩查出OSCC組織和癌旁組織中表達有顯著差異的環(huán)狀RNA，其中包括相對表達量比值在1.5倍以上的環(huán)狀RNA 155 條。環(huán)狀RNA hsa_circ_0001874顯示出與腫瘤臨床分期和分化程度密切相關，其在低分化的OSCC組織中表達明顯高于中、高水平分化的OSCC組織[38]。通過環(huán)狀RNA靶基因分析軟件的預測，推斷miR-103A-3P、miR-107、miR-593-5p、miR-661和miR-662可能是hsa_circ_0001874的海綿作用靶點，但具體的作用途經尚不明確。類似的研究還包括探究舌鱗狀細胞癌組織與正常癌旁組織中環(huán)狀RNA的表達譜特征，經過4例癌灶組織和4例癌旁組織的高通量測序，共篩選出17 171條有差異的環(huán)狀RNA，其中差異高達50倍的環(huán)狀RNA就有15條[39]。差異倍數116.31的上環(huán)狀RNA hsa-circ-0033967經預測有163個hsa-miR-608的潛在結合位點，而hsamiR-608在近年來已經被證實為在肝癌、膠質瘤中發(fā)揮抑癌作用的非編碼RNA[40]。這一發(fā)現提示了hsacirc-0033967可通過海綿作用阻礙hsa-miR-608的抑癌作用從而促進舌癌的發(fā)生發(fā)展。

一些環(huán)狀RNA已經被證明在OSCC惡性進程中存在特有信號通路，具有臨床應用價值。細胞周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent kinases 6，CDK6）在一些特異性階段通過調節(jié)轉錄應答促進腫瘤形成。研究[41]發(fā)現在OSCC組織中circRNA_100290水平上調并與CDK6協同表達，circRNA_100290表達缺失后會減少CDK6的表達，并抑制OSCC細胞株在體內外的增殖。circRNA_100290可以作為一個相互競爭的內源性RNA，通過海綿樣吸附miR-29家庭成員促進CDK6的表達來參與口腔癌的惡性進程。Wang等[42]以CAL-7、SCC-9、SCC-25 3種口腔鱗癌細胞系為基礎建立了細胞凋亡模型，對照組對比發(fā)現628種環(huán)狀RNA的表達存在差異，其中circRNA DOCK1是在細胞凋亡模型中表達量顯著下降的環(huán)狀RNA之一，實時熒光定量聚合酶鏈式反應發(fā)現這種環(huán)狀RNA在OSCC細胞系與組織中也存在高表達。在該種環(huán)狀RNA的低表達模型中，在多種細胞凋亡通路中起重要作用的miR-193a-5p表達水平上升，與此同時凋亡率有不同程度的增加。進一步實驗證明，miR-193a-5p可以與含桿狀病毒IAP重復基因（baculoviral IAP repeat containing，BIRC）的mRNA結合以降低BIRC在細胞中含量，使細胞凋亡率上升，進而證實了circDOCK1/miR-196a-5p/BIRC3信號通路的存在——circRNA DOCK1可通過調節(jié)蛋白BIRC的表達間接影響OSCC的細胞凋亡，體現了circRNA DOCK1作為診斷OSCC生物標志物及治療靶點的潛力。另有研究[43]發(fā)現，另一種環(huán)狀RNA也可能輔助OSCC的診斷，hsa_circ_1001242在SCC-9、SCC-15、SCC25、CAL-27 4個口腔鱗癌細胞系中表達明顯上升，且表達水平和腫瘤規(guī)模與T分期呈負相關。相似的，唾液中hsa_circ_0001874與hsa_circ_0001971在OSCC樣本中的表達顯著提高，更有作為OSCC腫瘤標志物判斷腫瘤發(fā)展程度的潛力，因為他們的含量均與OSCC的TNM分期有關，且前者與腫瘤分級相關，惡性程度更高的樣本中hsa_circ_0001874有著更高的表達水平。不僅如此，通過比較這兩種環(huán)狀RNA的表達水平的差異亦能區(qū)分出OSCC與口腔白斑組織，手術亦會降低2種環(huán)狀RNA在唾液中的含量[44]。

4.2 環(huán)狀RNA在OSCC中的應用價值

如今臨床上對于OSCC在早期診斷、手術方法、放化療治療上都取得了一定進展，但OSCC早期癥狀并不典型，最終確診往往需組織活檢，臨床工作中仍然缺乏快速、準確且無創(chuàng)的早期診斷標志物。環(huán)狀RNA具有豐富性、廣泛性、保守性，以及能在唾液、血液、尿液、外分泌囊泡中穩(wěn)定表達的特性，并在組織器官中的表達具有階段特異性，因此是一種極具潛力的生物標志物。由于OSCC發(fā)生部位均在口內，唾液樣本的檢驗可能成為一種OSCC高危標志物的早期篩查診斷方法，且操作簡單，無需通過侵入性操作來獲得樣本。一些研究[45-46]表明，唾液中的微小RNA（miRNA）和長鏈非編碼RNA（lncRNAs）可作為OSCC的早期診斷標志物。由于環(huán)狀RNA具有閉合環(huán)狀結構，相較于長鏈非編碼RNA對RNA酶的敏感性較低，且環(huán)狀RNA的半衰期往往高于48 h，而微小RNA的半衰期平均僅有10 h，因此環(huán)狀RNA作為標志物更為合適[47]。已有文獻表明唾液中存在OSCC特異性的環(huán)狀RNA，如前所述，OSCC患者唾液中has-circ-0001874與has-circ-0001971的含量明顯增高，可使用患者唾液樣本中顯著高表達的特定環(huán)狀RNA來作為診斷OSCC的有力證據[44]。類似的，環(huán)狀RNA也可以用作OSCC環(huán)狀預后的標志物，在患者經過手術或內科治療后，這些OSCC特異性的環(huán)狀RNA能作為患者定期隨訪的監(jiān)測指標[48]。

研究[49]表明，某些環(huán)狀RNA可以通過細胞內信號通路調控腫瘤細胞生物學行為，故環(huán)狀RNA被認為是未來OSCC分子生物學治療靶點之一，若可以通過藥物干擾環(huán)狀RNA作用通路，有望抑制OSCC細胞的增殖與促進凋亡?，F如今最主要的干擾環(huán)狀RNA表達的方法是通過數據庫查詢構建特定種類的環(huán)狀RNA的靶向小干擾RNA（siRNA），將其導入OSCC細胞，可以達到等同于該種環(huán)狀RNA編碼基因敲除的作用，從而阻礙癌細胞或癌組織的進一步發(fā)展。研究[41]發(fā)現，在OSCC細胞株內導入circRNA-100290的靶向siRNA，通過調節(jié)環(huán)狀RNA-miR29家族-CDK6通路達到抑制OSCC細胞株體內外增殖的作用。類似的，Wang等[50]通過導入環(huán)狀RNA DOCK1的siRNA構建了此種環(huán)狀RNA的低表達模型后發(fā)現，CAL-7、SCC-9、SCC-25 3種OSCC細胞系凋亡率上升。過分子生物學方法使促進OSCC惡性發(fā)展的環(huán)狀RNA保持低表達狀態(tài)有應用于臨床治療的潛力。

相反的，某些環(huán)狀RNA的過表達對癌細胞增殖與癌組織發(fā)展有一定抑制作用，通過人工手段合成有特定良性作用的環(huán)狀RNA并轉染至細胞從而達到治療效果已成為可能。已有學者[51]成功在體外合成可以明顯抑制癌細胞增殖的環(huán)狀RNA—scRNA21，這種環(huán)狀RNA導入細胞內可以通過海綿作用結合miR-21，從而上調原本被miR-21靶向抑制的抑癌基因Daxx的表達，進而誘導胃癌細胞的凋亡。通過提高環(huán)狀RNA的胞內含量進而影響OSCC細胞生物學行為，為治療OSCC提供了新的思路。

4.3 環(huán)狀RNA在OSCC中的現存問題

雖然環(huán)狀RNA作為OSCC診斷、預后的生物標記物以及治療的靶點都具有較高優(yōu)越性，但目前的研究成果仍具有較大的局限性。如在分析OSCC患者體內差異表達的環(huán)狀RNA時，樣本量的大小以及樣本的選取都將影響最終數據，而目前的研究成果尚不能代表所有OSCC患者情況，這些特異性的環(huán)狀RNA是否具有人群的普遍適用性還需進一步研究證明。

綜上所述，環(huán)狀RNA作為一種剛被發(fā)現具有特殊生物學功能的分子，具有良好的特異性與穩(wěn)定性，其作為腫瘤標志物的潛力已在胃癌[29-31]、結腸癌[26,34]、乳腺癌[32-33]等多種癌癥中得到證明。OSCC是一種易發(fā)生轉移且預后較差的癌癥，且它的發(fā)生與發(fā)展機制尚不明確，在分子水平上揭示OSCC的發(fā)生與發(fā)展的進程必將對OSCC的早期診斷、治療和預后提供更加高效與準確的方法。有關OSCC中環(huán)狀RNA作用的研究也陸續(xù)出現，為腫瘤的診斷與預后提供了新思路。

雖然有越來越多在腫瘤組織與正常組織之間差異表達的環(huán)狀RNA被發(fā)現，但只有很少部分的環(huán)狀RNA在細胞分子機制中的確切作用得到了闡明，絕大多數環(huán)狀RNA的作用機制尚無定論，仍存在大量未知等待探索。而且環(huán)狀RNA的腫瘤診斷標志物作用從理論過渡到臨床應用，成為一種簡便、高效、準確的實驗室檢查方法之前，尚需大量的研究作為基礎。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。