陳槿 尹榮 劉歆茵

近年來(lái)肺癌的發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，2018年全球肺癌新增病例約210萬(wàn)，而死亡病例高達(dá)176萬(wàn)。根據(jù)肺癌的臨床和組織病理學(xué)特征，可分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC占80%-85%，又分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞肺癌等。NSCLC預(yù)后較差，盡管近幾年分子靶向治療和免疫療法層出不窮，但因?yàn)樵S多患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于疾病的晚期，5年生存率仍不足20%[2]，且繼發(fā)性耐藥的產(chǎn)生極大限制了其臨床療效[3]。因此，深入研究NSCLC發(fā)生、發(fā)展及耐藥的分子機(jī)制，尋找早期診斷的生物標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善患者的預(yù)后意義深遠(yuǎn)。

隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們對(duì)長(zhǎng)非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）的研究不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)顯示，lncRNA在表觀遺傳、染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活等生物學(xué)過(guò)程中作為關(guān)鍵調(diào)控因子，發(fā)揮著重要的作用[4]。FEZ家族鋅指1反義RNA1（FEZ family zinc finger 1-antisense RNA 1, FEZF1-AS1）是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，在結(jié)腸癌、NSCLC、胰腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤的基因診斷、治療和預(yù)后評(píng)估等方面有著潛在的應(yīng)用前景[4-8]。本文將結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，將FEZF1-AS1在NSCLC中的作用機(jī)制及研究進(jìn)展作一闡述，為尋找NSCLC的診療方法提供新思路。

1 LncRNA簡(jiǎn)介

在人類基因組中超過(guò)90%的基因轉(zhuǎn)錄為RNA，但無(wú)法編碼蛋白質(zhì)，被統(tǒng)稱為非編碼RNA（non-coding RNA,ncRNA）。LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的ncRNA，根據(jù)其與相鄰編碼基因的位置關(guān)系可以大致分為正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因間lncRNA以及基因內(nèi)lncRNA幾類[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與了表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期及分化控制、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列生物學(xué)過(guò)程[4]。LncRNA的功能與其在細(xì)胞內(nèi)的定位有關(guān)，大多數(shù)核內(nèi)lncRNA通過(guò)招募DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶和組蛋白修飾基因來(lái)指導(dǎo)染色質(zhì)修飾，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。此外lncRNA的自身轉(zhuǎn)錄也可以調(diào)控其附近位點(diǎn)或遠(yuǎn)處基因的表達(dá)。而細(xì)胞質(zhì)中l(wèi)ncRNA主要通過(guò)堿基配對(duì)調(diào)節(jié)翻譯過(guò)程，同時(shí)它們還可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）結(jié)合并阻斷特異性的微小RNA（microRNA, miRNA），維持靶mRNA的穩(wěn)定性。LncRNA可以作為腫瘤促進(jìn)或抑制因子調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的凋亡、增殖和分化能力，并且與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，使其成為當(dāng)今分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)[6]。

2 FEZF1-AS1在腫瘤中的作用

FEZF1-AS1最早是于2004年由日本學(xué)者在分離人類全長(zhǎng)cDNA時(shí)發(fā)現(xiàn)的，它位于人基因組7號(hào)染色體7q31.32上，全長(zhǎng)2,653 bp，包含了7個(gè)外顯子區(qū)[7]。FEZF1-AS1屬于反義lncRNA，因其第一個(gè)外顯子區(qū)和FEZF1 mRNA的第一個(gè)外顯子區(qū)存在611個(gè)核苷酸的互補(bǔ)配對(duì)，從而命名為FEZF1-AS1[8]。目前已有研究表明，F(xiàn)EZF1-AS1作為癌基因在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等過(guò)程中起著十分重要的作用。

Gu所在團(tuán)隊(duì)[9]通過(guò)高通量測(cè)序及癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)分析等方法篩選出了包括FEZF1-AS1在內(nèi)的9種差異表達(dá)基因，并且發(fā)現(xiàn)它們對(duì)胃腺癌具有潛在的診斷價(jià)值。Kaplan-Meier分析顯示FEZF1-AS1高表達(dá)患者的總生存時(shí)間（overall survival,OS）及無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間（relapse-free survival, RFS）較短。受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve,ROC）結(jié)果表明FEZF1-AS1在胃癌診斷中具有較高的靈敏度和特異性[10]。Liu等[11]分別檢測(cè)了胃癌患者、胃良性病變患者及健康人血清中FEZF1-AS1的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與胃良性病變組和對(duì)照組相比，胃癌患者FEZF1-AS1水平顯著升高。同時(shí)，試者工作特征曲線分析發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1靈敏度和特異度明顯高于常規(guī)腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）和糖類抗原19-9（carbohydrate antigen19-9, CA19-9）。聯(lián)合檢測(cè)血清FEZF1-AS1、CEA和CA19-9可以增強(qiáng)胃癌診斷的敏感性。此外，他們發(fā)現(xiàn)胃癌術(shù)后患者血清中FEZF1-AS1水平較術(shù)前明顯下降。這些結(jié)果表明循環(huán)FEZF1-AS1可作為胃癌的潛在生物標(biāo)志物來(lái)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)控。在機(jī)制方面，Liu等[12]認(rèn)為FEZF1-AS1可以通過(guò)結(jié)合組蛋白去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1, LSD1）介導(dǎo)p21的啟動(dòng)子區(qū)組蛋白第三亞基四號(hào)賴氨酸的二甲基（dimethylation of lysine 4 on histone H3 protein subunit, H3K4me2）去甲基化，在表觀遺傳學(xué)水平上抑制p21表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。Wu等[10]則發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)EZF1-AS1后，β-catenin、c-myc和cyclin D1的表達(dá)降低，提示FEZF1-AS1可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

Chen等[13]應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)到FEZF1-AS1在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中均呈高表達(dá)。FEZF1-AS1的表達(dá)水平與T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。單因素和多因素分析表明FEZF1-AS1的高表達(dá)是結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素。他們提出FEZF1-AS1主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，且敲低FEZF1-AS1能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Bian等[14]通過(guò)裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌的肺轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移。蛋白質(zhì)體外結(jié)合（RNA pull-down）實(shí)驗(yàn)及質(zhì)譜分析結(jié)果預(yù)測(cè)丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase 2, PKM2）是 FEZF1-AS1的相關(guān)蛋白，生物學(xué)信息分析又發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3, STAT3）可以被FEZF1-AS1和PKM2所調(diào)控。他們認(rèn)為FEZF1-AS1可能通過(guò)增強(qiáng)PKM2的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的需氧糖酵解，激活STAT3信號(hào)通路來(lái)影響癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

乳腺癌是女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響了女性患者健康及生活質(zhì)量。而FEZF1-AS1在乳腺癌中同樣發(fā)揮著重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1可以降低乳腺癌干樣細(xì)胞的CD44+/CD24-比率和成球能力，且敲低FEZF1-AS1可以減少Nanog、Oct4、Sox2等干細(xì)胞因子的表達(dá)。進(jìn)一步的研究[15]表明，F(xiàn)EZF1-AS1通過(guò)與miR-30a結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)Nanog蛋白的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

3 FEZF1-AS1與NSCLC的預(yù)后及發(fā)生發(fā)展

He及其團(tuán)隊(duì)[16]通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常癌旁組織及人肺上皮細(xì)胞（16HBE）相比，F(xiàn)EZF1-AS1在NSCLC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào)。統(tǒng)計(jì)分析表明，F(xiàn)EZF1-AS1的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及腫瘤分化程度正相關(guān)。Gong等[17]檢測(cè)了160例NSCLC組織及其鄰近非腫瘤組織中FEZF1-AS1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)EZF1-AS1在腫瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)，并且其高表達(dá)與更高級(jí)別的腫瘤分期和腫瘤家族史有關(guān)。劉等[18]則發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中FEZF1-AS1的表達(dá)水平與組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時(shí)Kaplan-Meier曲線分析結(jié)果提示FEZF1-AS1是NSCLC的獨(dú)立預(yù)后因素，F(xiàn)EZF1-AS1高表達(dá)的患者生存時(shí)間顯著縮短。

為探索FEZF1-AS1在NSCLC中的生物學(xué)作用，He等[16]使用si-RNA敲低了A549及SPC-A1細(xì)胞中FEZF1-AS1的表達(dá)。MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn)證實(shí)，與si-NC組相比FEZF1-AS1下調(diào)降低了肺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力。此外，Transwell實(shí)驗(yàn)表明敲低FEZF1-AS1的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲力有著顯著的抑制作用。有研究[19]證實(shí)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）過(guò)程與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EMT是指上皮細(xì)胞喪失細(xì)胞極性以及細(xì)胞間的黏附連接能力，轉(zhuǎn)化成為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞，同時(shí)EMT還伴隨著關(guān)鍵性上皮性標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）以及間質(zhì)性標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）的改變。在Western blot試驗(yàn)中，他們發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1可以降低NSCLC細(xì)胞中E-cadherin及ZO-1蛋白表達(dá)，并增加Slug、Twist和Vimentin的表達(dá)水平。而E-cadherin是細(xì)胞侵襲和EMT過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，表明FEZF1-AS1可以通過(guò)抑制EMT促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲。目前研究普遍認(rèn)為lncRNA可以通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白作用來(lái)調(diào)控潛在的靶標(biāo)。隨后He團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）和染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)FEZF1-AS1可以直接結(jié)合Zeste基因增強(qiáng)子同源物2（enhancer of zeste homolog 2, EZH2）和LSD1，而敲低FEZF1-AS1則會(huì)降低EZH2及LSD1與E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力，即沉默F(xiàn)EZF1-AS1可以上調(diào)E-cadherin的表達(dá)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1表達(dá)下調(diào)后可以增加A549細(xì)胞中Axin1的表達(dá)，并降低β-catenin和TCF4的表達(dá)，這表明FEZF1-AS1也可以通過(guò)調(diào)節(jié)NSCLC中的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)活性來(lái)參與EMT進(jìn)程。

Jin等[20]發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)EZF1-AS1可將肺腺癌細(xì)胞阻滯在G1期，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。進(jìn)一步的研究[21]表明，在肺癌細(xì)胞中敲低FEZF1-AS1后p57的表達(dá)升高。P57因其對(duì)于腫瘤細(xì)胞增殖起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，而被認(rèn)為是種抑癌基因。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，人肺癌中存在著p57基因組印記的缺失，p57可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白依賴激酶以及增殖細(xì)胞核抗原，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)EZF1-AS1在細(xì)胞核中的表達(dá)明顯高于細(xì)胞質(zhì)，提示FEZF1-AS1可能主要在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用。隨后的RIP實(shí)驗(yàn)及RNA pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)EZF1-AS1能夠與RNA結(jié)合蛋白EZH2和LSD1直接綁定。ChIP測(cè)定發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1主要通過(guò)將EZH2及LSD1募集到p57的啟動(dòng)子區(qū)域，并誘導(dǎo)組蛋白修飾來(lái)調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞中的p57表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生和發(fā)展。

有研究認(rèn)為反義RNA可以通過(guò)直接與互補(bǔ)的mRNA序列結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)親本編碼基因的表達(dá)。Gong等[17]為探究FEZF1-AS1作為反義RNA是否也存在類似作用機(jī)制，檢測(cè)了58例NSCLC組織中FEZF1-AS1及FEZF1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1的表達(dá)水平和FEZF1呈正相關(guān)。隨后研究者又通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了969例NSCLC患者中FEZF1-AS1和FEZF1的表達(dá)，并得到了相似的結(jié)論。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)兩者的外顯子存在部分重疊，猜測(cè)FEZF1-AS1可能通過(guò)結(jié)合FEZF1基因調(diào)節(jié)其表達(dá)。在胃癌中，有研究指出FEZF1-AS1的啟動(dòng)子區(qū)包含一個(gè)保守的SP1結(jié)合位點(diǎn)，而FEZF1基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化，組蛋白乙?；娃D(zhuǎn)錄因子SP1結(jié)合可誘導(dǎo)FEZF1基因轉(zhuǎn)錄激活，而肺癌中相關(guān)的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討[12]。劉等[18]發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞中敲低FEZF1-AS1后其有義同源基因FEZF1 mRNA和蛋白的表達(dá)均受到抑制。而使用小干擾RNA下調(diào)FEZF1基因的表達(dá)后FEZF1-AS1的表達(dá)水平也明顯下降。為了證明FEZF1-AS1和FEZF1之間的相互作用，研究者在肺癌細(xì)胞系中進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，結(jié)果表明干擾FEZF1-AS1表達(dá)無(wú)法改變FEZF1的熒光素酶活性。

4 FEZF1-AS1與EGFR-TKIs耐藥相關(guān)的可能機(jī)制

肺癌治療是目前的研究熱點(diǎn)，因傳統(tǒng)放化療臨床療效有限，患者5年生存率不足15%。以表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）為代表的分子靶向治療的出現(xiàn)是肺癌治療領(lǐng)域突破性的進(jìn)展，大幅延長(zhǎng)了患者的生存期，提高了患者生存質(zhì)量。在我國(guó)約有50%的肺腺癌患者攜帶有EGFR基因突變，除部分原發(fā)耐藥患者外（約10%），EGFR-TKIs對(duì)于EGFR敏感突變的患者療效顯著。然而隨之而來(lái)的獲得性耐藥的產(chǎn)生，成為了臨床抗腫瘤治療的一大難題。常見(jiàn)的耐藥機(jī)制包括EGFRT790M、c-MET擴(kuò)增、HER2擴(kuò)增、BRAF突變及小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化等，但有約30%的機(jī)制仍不明確。有研究[22]顯示lncRNA在耐藥細(xì)胞及組織中表達(dá)異常，為EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制研究提供了新的思路。例如lncRNA UCA1、MIR31HG可以通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞對(duì)吉非替尼產(chǎn)生耐藥性[23,24]。BC087858可能通過(guò)調(diào)控EMT進(jìn)程在EGFR-TKIs獲得性耐藥中發(fā)揮作用[25]，而FEZF1-AS1也被證實(shí)是這些通路中的重要調(diào)節(jié)因子。Li等[26]發(fā)現(xiàn)miR-610能夠與FEZF1-AS1的3’端非翻譯區(qū)（3-untranslated region, 3’UTR）結(jié)合，且AKT3的表達(dá)與miR-610的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。沉默F(xiàn)EZF1-AS1可以降低AKT3 mRNA和蛋白的表達(dá)，而FEZF1-AS1與AKT3的表達(dá)呈正相關(guān)，表明FEZF1-AS1可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-610/AKT3軸以促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖。Wang等[27]提出JAK2/STAT3信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞EMT進(jìn)程中起著不可或缺的作用，沉默F(xiàn)EZF1-AS1能夠抑制STAT3的磷酸化，且敲低FEZF1-AS1后N-鈣粘蛋白（N-cadherin）和Vimentin表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)升高，從而抑制了EMT過(guò)程。然而，F(xiàn)EZF1-AS1在EGFR-TKIs耐藥中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究，為實(shí)現(xiàn)其臨床潛力提供新的理論基礎(chǔ)。

5 總結(jié)及展望

綜上所述，lncRNAFEZF1-AS1作為一種致癌基因，通過(guò)招募多梳抑制復(fù)合體、競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA、調(diào)控信號(hào)通路等方式在NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。全面深入地了解FEZF1-AS1，也將在NSCLC的診斷、治療以及預(yù)后評(píng)估等臨床應(yīng)用中產(chǎn)生重要的價(jià)值。