梁宇 侯和磊 姜曼 張傳濤 劉棟 張曉春

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因[1]。研究[2,3]表明，肺癌發(fā)生的風險與許多因素相關(guān)，年齡是其中之一，對其進一步研究能指導許多癌癥的治療。NSCLC過去被認為是一種老年疾病，年輕患者只占很小的比例[4,5]。值得注意的是，年輕人中NSCLC的發(fā)病率有逐年升高的趨勢[6]。

年輕時就發(fā)生NSCLC的患者有未知的危險因素，相關(guān)的研究也較少[7,8]。與老年NSCLC患者相比，年輕患者的相對預(yù)后仍存在爭議。來自美國國家癌癥數(shù)據(jù)庫的研究[5]表明，年輕NSCLC患者的總體生存率高于老年患者，發(fā)現(xiàn)時分期較早的患者有更大的臨床獲益?；仡櫺苑治鯷4]發(fā)現(xiàn)，年輕的NSCLC患者的預(yù)后較差，尤其是當患者未進行驅(qū)動基因突變篩查，且應(yīng)用最常用的鉑類為基礎(chǔ)的雙聯(lián)療法為治療方案時。因此，必須明確年輕NSCLC患者的分子特征和臨床行為，并開發(fā)一種個體化的治療方法來改善這一人群的預(yù)后。

以往很少有報道關(guān)注包括肺腺癌在內(nèi)的年輕NSCLC患者靶向基因突變的發(fā)生率，而現(xiàn)在它吸引了越來越多的研究。最近的數(shù)據(jù)[9-13]表明，年輕的肺腺癌患者具有獨特的分子特征，并具有高頻率的驅(qū)動基因突變，如間變淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）基因重排。然而，在一項小規(guī)模研究[14]中，中國年輕人和老年人肺腺癌的癌基因突變沒有發(fā)現(xiàn)差異。就年輕肺腺癌患者中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變的幾率而言，最近幾項研究的結(jié)果存在爭議[9,10,13]。因此，年輕患者的定義、種族、年輕肺腺癌患者的相對罕見性以及所使用的基因檢測方法等因素使得這項研究更趨復雜化。

盡管在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)了大量驅(qū)動基因突變，但在上述研究中，通過低通量分析對年輕患者僅研究了少數(shù)驅(qū)動基因。在這項研究中，廣泛的、基于雜交捕獲的下一代測序（next-generation sequencing, NGS）分析被用于確定年輕肺腺癌患者的靶向基因突變，這為我們提供了該人群基因組學更全面的信息。

1 材料和方法

1.1 患者和樣本 樣本經(jīng)蘇木素-伊紅染色證實為腺癌。所有福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣本均由合格的病理學專家進行檢查，以確認腺癌的診斷，并確保腫瘤含量＞30%。根據(jù)第8版國際肺癌腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期對患者病灶進行分期[15,16]。這項研究經(jīng)青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準。所有參與研究的患者均已簽署知情同意書。所有實驗均按照青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會和中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會的指導方針進行。

1.2 基于NGS的分析 在這項研究中，184例患者的組織樣本使用基于目標基因捕獲技術(shù)的NGS技術(shù)對其分析。184例患者的28個基因均存在驅(qū)動基因突變。然而，這3個版本的NGS分析所涵蓋的28個基因中只有16個被選擇用于進一步分析（http://dx.doi.org/10.3779/j.issn.1009-3419.2020.04.05）。這項研究重點關(guān)注OncoKB知識庫中1級-3級和R1級證據(jù)類別注釋的驅(qū)動基因改變。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差（Mean±SD）。采用Pearson卡方檢驗、Fisher精確檢驗和Studentt檢驗分析兩組間的基因突變情況和患者特征。在所有的測試中，P值都是雙尾的。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究設(shè)計和患者特征 對2013年1月-2019年6月于青島大學附屬醫(yī)院確診的2,882例肺腺癌患者進行了篩查。其中45歲以下患者109例，占總病例數(shù)的3.8%。其中收集了89例患者的組織標本進行NGS分析。此外，還收集了95例在此期間接受過NGS檢測的腺癌病例進行比較研究。

184例肺腺癌患者NGS檢測的臨床特征見表1。所有患者的平均年齡為51歲（24歲-85歲）；63.6%（117/184）的患者為女性，71.2%（131/184）的患者從不吸煙。0期疾病占1.7%（3/184），I期疾病占30.4%（56/184），II期疾病占8.2%（15/184），III期疾病占15.2%（28/184），IV期疾病占44.6%（82/184）。共收集174例原發(fā)性腫瘤組織標本和10例轉(zhuǎn)移組織切片進行NGS分析。

2.2 目標基因譜與年齡的關(guān)系 在先前的研究中，年齡截止點40歲[10-12,14,17]、45歲[18]、46歲[5]和50歲[13,19]在NSCLC的研究中都曾被定義為年輕。在這項研究中，通過比較三個年齡組的目標基因突變頻率來確定一個合理的年齡臨界點。如圖1所示，前兩組的靶向基因突變差異無顯著統(tǒng)計學意義（P=0.564）。然而，前兩組與第三組（45歲以上）有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。值得注意的是，年齡在40歲以下和41歲-45歲之間的患者的ALK突變頻率（24.3%vs9.6%,P=0.072）遠高于年齡在45歲以上的患者（1.1%）。因此，我們將45歲的診斷年齡作為區(qū)分年輕患者和老年患者的臨界點。

表1 高通量測序法檢測184例肺腺癌患者的臨床特征Tab 1 Clinical characteristics of 184 patients with lung adenocarcinoma with next-generation sequencing assay

2.3 年輕肺腺癌患者靶向基因突變的患病率 在184例肺腺癌患者中，89例年齡≤45歲的患者被分為年輕組，95例年齡≥46歲的患者被分為老年組。在年齡、性別、吸煙史、年齡分布上，年輕組與老年組有顯著差異（表1）。年輕組女性較多，吸煙者少，早期腺癌多。兩組腫瘤標本來源差異無統(tǒng)計學意義。

91.0%的年輕患者存在驅(qū)動基因突變。在驅(qū)動基因中觀察到的突變包括：EGFR（n=49, 55.1%）、KRAS（n=3, 3.4%）、ALK（n=14, 16.0%）、BRAF（n=3, 3.4%）、ROS1（n=2, 2.2%）、RET（n=1, 1.1%）、HER2突變（n=5,5.6%）、CDKN2A（n=1, 1.1%）、HER2擴增（n=1, 1.1%）、HRAS（n=1, 1.1%）和MAP2K1（n=1, 1.1%）（圖2A）。此外，在86.3%的老年患者中發(fā)現(xiàn)的驅(qū)動基因突變包括：EGFR（n=49, 51.6%）、KRAS（n=18, 18.9%）、ALK（n=1, 1.1%）、BRAF（n=1, 1.1%）、MET（n=2, 2.1%）、RET（n=1, 1.1%）、ROS1（n=3, 3.2%）、HER2擴增（n=4, 4.2%）和STK11（n=3,3.2%）（圖2B）。年輕組和老年組在NGS檢測的靶向基因圖譜上存在顯著差異（P＜0.001；圖2C）。更重要的是，80.9%（72/89）的年輕患者對美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network , NCCN）指南（2019.V3版更新，NSCLC）批準的治療方法存在靶向基因突變，而老年患者的這一比例為55.8%（53/95）。

就所有已分析的驅(qū)動基因突變而言，只有KRAS突變和ALK重排的分布在年輕組和老年組之間存在顯著差異。與老年組相比，年輕組的KRAS突變頻率較低（3.4%vs18.9%,P=0.002），而年輕組的ALK排列明顯較高（15.9%vs1.1%,P＜0.001）。年輕組和老年組之間的EGFR突變率相當（分別為57.6%和51.6%；P=0.657），而兩組之間的EGFR突變亞型分布有顯著差異（P=0.023）。在EGFR突變型肺腺癌患者中，EGFR19外顯子缺失及21外顯子L858R突變的檢出率最高，在所有突變亞型中，20外顯子在年輕組中突變的頻率較低（P=0.005），而其余突變亞型在兩組之間的頻率相似。

對于某些患者而言，若同時存在多個驅(qū)動基因突變，則已上市的靶向藥物和實驗藥物均可應(yīng)用。根據(jù)臨床治療效果劃分，可以分為首要干預(yù)靶點及次要干預(yù)靶點，當只考慮首要靶點基因突變頻率時，年輕組和老年組之間沒有顯著差異。然而，當分析所有單一和多基因突變時，在年輕組中可以看到更高頻率的HER2靶向突變和低頻率的STK11突變（HER213.8%vs4.4%,P=0.037;STK111.1%vs8.9%,P=0.035）。

圖1 不同年齡組肺腺癌患者的基因突變。共納入184例肺腺癌患者，用NGS法分析組織標本。比較三個年齡組的靶向基因突變頻率，以確定一個年齡臨界點，該臨界點可以區(qū)分具有獨特分子特征的年輕患者。Fig 1 The genetic profiles in different age groups of patients with lung adenocarcinoma. One hundred and seventy-seven patients with lung adenocarcinoma patients were enrolled, and tissue samples were analyzed by NGS assays. The frequency of targeted genetic alterations across three age groupings was compared to determine an age cutoff point that could differentiate young patients with a distinctive molecular profile. STK11: serine/threonine kinase 11; ROS1: c-ros oncogene 1; MET: mesenchymal-epithelial transition; MAP2K1: mitogen-activated protein kinase kinase 1; HRAS: v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog; Her2: human epidermal growth factor receptor 2; CDKN2A: cyclin dependent kinase inhibitor 2A; RET: rearranged during transfection; BRAF: v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B; ALK: anaplastic lymphoma kinase; KRAS: v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog; EGFR: epidermal growth factor receptor; NGS: next-generation sequencing.

2.4 對年輕肺腺癌患者TP53基因突變的研究 在無相應(yīng)靶向藥物的基因突變中，最常見的突變基因是TP53。TP53突變在年輕組和老年組中有相似的發(fā)生率（55.1%vs47.3%,P=0.365）。然而，在EGFR突變的患者中，伴有TP53同時突變比ALK重排的患者更為常見（63.3%vs13.2%,P＜0.001）。值得注意的是，在EGFR突變患者中，與老年患者相比，年輕患者中同時出現(xiàn)TP53突變的頻率更高（64.5%vs35.5%,P＜0.001）。見圖3。

3 討論

年輕NSCLC患者已引起了越來越多的關(guān)注，其發(fā)病例占所有患者的比例不到5.0%[5,17,18,20]。許多研究[5,7,14,16]表明，年輕人的NSCLC具有獨特的特征，女性患者、腺癌患者和從不吸煙者的比例更高，這一特點并不局限于中國，歐美也有相關(guān)報道[15]年輕的肺腺癌患者，尤其是晚期患者，盡管接受了更積極的治療，但總體生存率并沒有明顯高于老年患者[14]。盡管隨著基因組檢測技術(shù)的進步和靶向藥物的開發(fā)，肺腺癌的治療正在迅速改變，但年輕患者的分子病理特征尚未得到很好的研究。最近的一份報告[13]表明，年齡越小，NSCLC（包括肺腺癌）中攜帶目標基因型的可能性越高。以前關(guān)于年輕肺腺癌患者分子特征的大多數(shù)數(shù)據(jù)都是不一致的，只有少數(shù)的驅(qū)動基因是通過非NGS分析進行研究的[9,10,12-14]。使用NGS進行全面的基因組分析可以發(fā)現(xiàn)非NGS分析漏掉的驅(qū)動基因突變，并加速針對罕見突變基因的靶向藥物的開發(fā)[21,22]。這項研究通過廣泛靶向的NGS檢測，對青年肺腺癌患者的基因特征進行了全面的鑒定。45歲以下的患者具有獨特的基因突變特征，45歲可能是確定年輕人肺腺癌的有效年齡界限。值得注意的是，與老年患者相比，年輕患者存在針對NCCN批準上市的藥物對應(yīng)的靶向基因突變的比率要高得多。

圖2 年輕和老年肺腺癌患者的靶向基因圖譜。A：年齡小于45歲的年輕患者的靶向基因圖譜；B：45歲以上老年患者的靶向基因圖譜；C：青年組與老年組靶向基因突變頻率的比較分析。Fig 2 The targeted genetic profiles of younger and older patients with lung adenocarcinoma. A: The targeted genetic profile of the younger patients, aged less than 45 years; B: The targeted genetic profile of the older patients, aged more than 45 years; C: The comparative analysis of the frequency of targeted genetic alterations between the younger and the older group. amp: amplification;mut: mutation.

圖3 年輕和老年肺腺癌患者EGFR突變亞型分析Fig 3 EGFR mutation subtypes profiles of younger and older patients with lung adenocarcinoma. Exon: expressed region.

特別的是，在年輕的肺腺癌患者中，ALK的突變頻率較高，KRAS的頻率較低，這與之前的研究一致[9,10,13]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)這些基因突變的發(fā)生率相似，這可能歸因于年輕病例的數(shù)量少[14,23]此外，這項研究表明，年齡與標準基因分型通常忽略的罕見基因突變之間存在關(guān)聯(lián)。在這項研究中，年輕患者中發(fā)現(xiàn)了更高頻率的HER2突變和較低頻率的STK11突變。曾有報道稱年輕腺癌患者的HER2基因突變頻率明顯高于老年組[10]。然而，在最近的一項研究中，HER2突變發(fā)生的年齡向年輕化的趨勢并不顯著，在這項研究中，只研究了HER220外顯子中的幀插入[13]。上述結(jié)果強調(diào)，所有類型的HER2突變，包括擴增，可能是青年肺腺癌患者的一個有價值的靶點。

與ALK重排相比，年輕肺腺癌患者EGFR突變的患病率存在很大爭議。與老年人相比，年輕肺腺癌患者EGFR突變的頻率或更高或更低[10,13,19]。在這項研究中，年輕人和老年人之間沒有發(fā)現(xiàn)EGFR突變類型或EGFR敏感突變的差異。我們的發(fā)現(xiàn)與另外三項針對年輕肺腺癌患者的研究[9,14,22]一致。有趣的是，在我們的研究中，能預(yù)測對臨床可用的EGFR-TKIs存在抵抗的EGFR20外顯子突變在年輕患者中較少發(fā)生。上述關(guān)于年輕肺癌患者EGFR基因突變特點的研究中，相互矛盾的數(shù)據(jù)可能歸因于種族、年齡界限和病理學，這需要進一步的研究。

年齡越小，攜帶靶向基因型的可能性越高，但與其他年齡組相比，年輕的NSCLC患者的生存率卻出乎意料地低，這表明其生物學行為更具侵略性[13]。先前的研究也暗示年輕肺腺癌患者EGFR-TKIs的療效較差[19]。年輕的EGFR突變腺癌患者在EGFR-TKI治療下預(yù)后不佳的原因尚不清楚，部分原因是該亞群中有更多的腦轉(zhuǎn)移[24]。許多機制被發(fā)現(xiàn)與晚期NSCLC對EGFR-TKIs的原發(fā)性耐藥有關(guān)，并激活了EGFR突變[25]。除了這些機制外，已經(jīng)證明，在EGFR突變的NSCLC患者中，通常并發(fā)的TP53突變降低了對EGFR-TKIs的敏感性，并使預(yù)后更差[26-28]。在這項研究中，年輕患者與老年患者相比，沒有發(fā)現(xiàn)更高的TP53突變率，這與之前的一項發(fā)現(xiàn)不一致[14]。然而，我們發(fā)現(xiàn)年輕患者發(fā)生EGFR/TP53共突變比老年患者要高得多。更重要的是，在Canale等[27]的研究中部分EGFR/TP53共突變的患者的隨訪數(shù)據(jù)顯示，EGFR-TKI治療的療效不佳，即有TP53突變的患者，其疾病進展的風險是TP53野生型患者的3倍。考慮到EGFR/TP53共突變的發(fā)生占年輕患者EGFR突變的80%以上，我們的研究可能揭示了EGFR-TKIs在這一特定人群中的預(yù)后不良和用藥低效的部分原因。據(jù)報道，年輕肺腺癌患者預(yù)后較差，年輕人肺腺癌血管生成與p53表達的相關(guān)性比老年人高[29]。因此，埃羅替尼聯(lián)合貝伐珠單抗治療年輕人并發(fā)EGFR/TP53變異性肺腺癌可能是一種最佳方案，值得進一步開展深入的研究來驗證這一推論[30,31]。

雖然這項研究針對年輕肺腺癌患者的基因特征進行了大量NGS研究，但這項研究仍有一定局限性。研究中的患者均為中國人，來自同一機構(gòu)，隨訪數(shù)據(jù)僅適用于少數(shù)患者。此外，46歲-50歲之間的研究對象（僅5例）的數(shù)量太少，無法作為年齡組進行分析。因此，對于具有獨特遺傳特征的年輕NSCLC患者，其年齡臨界點的確定尚需進一步研究。

4 結(jié)論

年輕肺腺癌患者是一個較少被研究的人群，他們有高頻率的ALK重排、HER2突變和EGFR/TP53共突變率。在年輕肺腺癌患者中發(fā)現(xiàn)的獨特驅(qū)動基因需要我們更多的關(guān)注其個體化治療。

Author contributions

Zhang XC and Liu D conceived and designed the study.Liang Y and Hou HL collected the data. Liang Y, Hou HL,Jiang M and Zhang CT analyzed the data. Zhang XC provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.