王伙根，羅 程，張森林

（嘉興恒杰生物制藥股份有限公司，浙江嘉興 314005）

采用分離的方法在動(dòng)物軟骨中提取高分子量酸性茹多糖，即硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS），其作用是促進(jìn)軟骨再生，并且具有抗炎、降血脂、預(yù)防關(guān)節(jié)炎等效果。將硫酸軟骨素制作成相關(guān)產(chǎn)品，比較常見(jiàn)的有滴眼液、化妝品，一些歐美國(guó)家將硫酸軟骨素作為關(guān)節(jié)炎、心絞痛等疾病的治療元素。采用發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素，有利于提高產(chǎn)品質(zhì)量與效益，降低污染與能耗，下面結(jié)合發(fā)酵型硫酸軟骨素展開(kāi)討論。

1 發(fā)酵型硫酸軟骨素

硫酸軟骨素是一種胺聚糖類(lèi)大分子酸性多糖，萃取來(lái)源為鯊魚(yú)、牛、豬等動(dòng)物的軟骨，在人體中常見(jiàn)于軟骨、肌腱等結(jié)締組織，將CS、透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、核心蛋白聚合之后，便可以獲得蛋白聚糖，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有極高的應(yīng)用價(jià)值，有人體“軟黃金”之稱(chēng)[1]。另外，CS也可以作為膳食補(bǔ)充劑、保濕劑在食品與化妝品行業(yè)得到運(yùn)用。

因?yàn)榱蛩峄a(chǎn)生位點(diǎn)存在差異，CS也被劃分為不同的種類(lèi)，動(dòng)物中提取硫酸軟骨素單體以CS-A，C為主。實(shí)施CS的工業(yè)化生產(chǎn)，一般會(huì)在酶法、堿法中選擇合適的工藝，在動(dòng)物氣管與雞龍骨等軟組織內(nèi)完成提取。我國(guó)作為CS產(chǎn)業(yè)大國(guó)，在全世界CS總產(chǎn)量中占比達(dá)到80%，雖然如此，但是CS原料生產(chǎn)環(huán)節(jié)，卻依然面臨周期過(guò)長(zhǎng)、工藝繁瑣、效率低等量問(wèn)題。所以，解決CS原料、生產(chǎn)技術(shù)、產(chǎn)品質(zhì)量等方面的問(wèn)題，科學(xué)選擇生產(chǎn)工藝非常重要。

CS不僅存在于動(dòng)物軟骨組織中，還通過(guò)莢膜多糖這一形式存在于微生物細(xì)胞壁，采用發(fā)酵法培養(yǎng)微生物細(xì)胞也能夠獲得CS，這是經(jīng)濟(jì)效益相對(duì)較高的生產(chǎn)工藝之一。發(fā)酵法在硫酸軟骨素生產(chǎn)中應(yīng)用，可以解決以上問(wèn)題，并且成為當(dāng)前生產(chǎn)、研究的重點(diǎn)。

2 采用發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素

生產(chǎn)、聚合硫酸軟骨素與類(lèi)似物，可以將自然界中的微生物作為主要原料，如果是在工業(yè)領(lǐng)域生產(chǎn)菌株，多采用巴斯德桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等微生物。其中，大腸桿菌屬于原核模式微生物，具有清晰的遺傳背景，在莢膜多糖合成、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制這兩個(gè)方面有非常深入的探究，也是CS與類(lèi)似物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵性菌株。但是大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物是K4CPS，果糖軟骨素務(wù)必要在脫果糖、硫酸化修飾等多個(gè)環(huán)節(jié)的處理之后方可得到CS，使得生產(chǎn)工藝更加復(fù)雜，也直接增加了成本。盡管巴斯德桿菌可以通過(guò)合成獲得軟骨素類(lèi)莢膜多糖，但是其中涉及家禽霍亂致病菌。所以，當(dāng)前針對(duì)發(fā)酵型CS的生產(chǎn)研究，多是以巴斯德桿菌typeF中軟骨素作為酶pmCS合成的主要來(lái)源，將其體外酶轉(zhuǎn)化之后可以得到軟骨素多糖鏈。納豆芽胞桿菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵后可以獲得硫酸軟骨素，但是這種方法產(chǎn)量不高，只有0.24g/L，選擇產(chǎn)量較高的CS枯草芽孢桿菌，將其發(fā)酵處理后進(jìn)行優(yōu)化，可以提高CS產(chǎn)量為4.2g/L（32h）[2]。其中運(yùn)用到的枯草芽孢桿菌是CS生產(chǎn)菌，可以保證生產(chǎn)產(chǎn)品的安全性，節(jié)省生產(chǎn)過(guò)程中的硫酸化修飾環(huán)節(jié)。所以，枯草芽孢桿菌在發(fā)酵型硫酸軟骨素生產(chǎn)中，可以作為最佳菌株得到應(yīng)用。

為了能夠顯著提升CS產(chǎn)量，建議將大腸桿菌O5：K4：H4當(dāng)作出發(fā)菌株，設(shè)置隨機(jī)誘變條件為N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍，篩選條件則設(shè)定為莢膜圈。經(jīng)過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)之后，突變株產(chǎn)量可以提高80%。分析高產(chǎn)生理機(jī)制總結(jié)，軟骨素合成酶密碼子在發(fā)酵生產(chǎn)期間出現(xiàn)錯(cuò)義突變，增加了親和力。由此可見(jiàn)，軟骨素合成酶對(duì)于CS合成效率的提升起到重要作用。針對(duì)合成莢膜多糖的渠道進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中單糖前體是多糖聚合酶底物，含量的豐富性是CS多糖合成效率非常關(guān)鍵的影響因素之一[3]。因此，大腸桿菌內(nèi)部UDP-葡萄糖脫氫酶的過(guò)量表達(dá)，顯著提升了UDP-GlcA的含量，莢膜多糖產(chǎn)量降低?？芍绻皇菃为?dú)提高前體物質(zhì)的含量，會(huì)對(duì)多糖成酶產(chǎn)生一種競(jìng)爭(zhēng)性的抑制效果。合成莢膜多糖的過(guò)程中包含諸多流程，例如單糖合成、核糖供應(yīng)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，若想提高CS產(chǎn)量，建議從轉(zhuǎn)錄水平著手優(yōu)化表達(dá)莢膜多糖合成基因簇。

因?yàn)榇竽c桿菌野生質(zhì)粒對(duì)外源質(zhì)粒有排斥作用，會(huì)遺失重組質(zhì)粒，發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間以24h為宜，所有重組質(zhì)粒遺失，從而影響到重組菌的培養(yǎng)規(guī)模。所以，提高K4菌株內(nèi)部目的基因穩(wěn)定性，是進(jìn)行分子改造非常重要的目的，建議采用以下三種方法：第一，將內(nèi)源質(zhì)粒全部清除，消除排斥性；第二，可以兼容內(nèi)源質(zhì)粒的外源質(zhì)粒當(dāng)作載體得到應(yīng)用；第三，將內(nèi)源質(zhì)粒當(dāng)作載體。以上三種方法必須要以解析質(zhì)粒pK4EC05的特性為基礎(chǔ)，pK4EC05測(cè)序結(jié)束之后便可以總結(jié)得出插入外源基因，提高CS產(chǎn)量。

3 發(fā)酵型硫酸軟骨素研究現(xiàn)狀與前景

3.1 研究現(xiàn)狀

雖然枯草芽孢桿菌在CS生產(chǎn)中屬于潛在生產(chǎn)菌株，但是相關(guān)研究處于不夠深入，最早關(guān)于CS的研究是在1988年，當(dāng)時(shí)大腸桿菌O10：K4：H4莢膜多糖結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定為果糖軟骨素，隨后在1996年針對(duì)K4菌株發(fā)酵展開(kāi)探究，發(fā)現(xiàn)Rodriguez發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)24h之后CS產(chǎn)量顯著提高，由此也肯定了發(fā)酵法在CS生產(chǎn)中的地位[4]。

首先，在發(fā)酵條件方面，莢膜多糖合成、細(xì)胞生長(zhǎng)這兩者的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、能量存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，所以碳源可以作為一種重要的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率進(jìn)行調(diào)整。對(duì)比葡萄糖、甘油 這兩種物質(zhì)在大腸桿菌莢膜多糖、生長(zhǎng)效率兩個(gè)方面的作用，發(fā)現(xiàn)濃度提升之后均可以提升莢膜多糖產(chǎn)量，對(duì)比發(fā)現(xiàn)甘油的效果更為理想。如果氮源量少，那么葡萄糖濃度一旦增加，便會(huì)在發(fā)酵液內(nèi)形成副產(chǎn)物，對(duì)莢膜多糖合成產(chǎn)生抑制作用。如果甘油吸收率低，糖酵解代謝流與副產(chǎn)物產(chǎn)生量也會(huì)因此降低，這時(shí)濃度增加之后也會(huì)加速莢膜多糖合成。

其次，細(xì)胞壁中莢膜多糖是非常重要的一部分，合成效率與胞內(nèi)能量狀態(tài)有直接關(guān)系。高溶氧保證胞內(nèi)能量充足供應(yīng)，加速多糖合成。如果DO值不足10%，則CS比合成速率降低幅度明顯，甘油消耗加速，發(fā)酵液內(nèi)部有副產(chǎn)物產(chǎn)生。

再次，對(duì)于發(fā)酵工藝的選擇，莢膜多糖屬于細(xì)胞表面成分，如果微生物處于指數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)合成CS會(huì)在轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期之后產(chǎn)量達(dá)到最高。如果是在高溶氧環(huán)境下，不斷補(bǔ)充碳氮源，細(xì)胞濃度與莢膜多糖產(chǎn)量也顯著提升。但是副產(chǎn)物大量積累之后細(xì)胞得率、轉(zhuǎn)化率卻相對(duì)降低。建議運(yùn)用微膜生物反應(yīng)器，將微生物細(xì)胞截留，可以減少副產(chǎn)物產(chǎn)生量，消除高密度培養(yǎng)期間細(xì)胞副產(chǎn)物具有的抑制作用，提高CS產(chǎn)量與細(xì)胞得率。

3.2 研究前景

現(xiàn)如今，受到全球老齡化趨勢(shì)的影響，硫酸軟骨素在臨床與市場(chǎng)中的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，根據(jù)研究預(yù)計(jì)今后硫酸軟骨素年復(fù)合增長(zhǎng)率需求、市場(chǎng)容量、產(chǎn)量將會(huì)不斷提升。另外，在實(shí)踐應(yīng)用方面，我國(guó)的藥用硫酸軟骨素的市場(chǎng)規(guī)模也呈現(xiàn)擴(kuò)張的趨勢(shì)，發(fā)酵法作為硫酸軟骨素的生產(chǎn)工藝之一，目前已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，憑借其在生產(chǎn)質(zhì)量、效率、環(huán)保等方面的優(yōu)勢(shì)，今后必將會(huì)得到重視，為硫酸軟骨素生產(chǎn)提供先進(jìn)工藝支持。

4 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，硫酸軟骨素作為我國(guó)醫(yī)療、食品與化妝品等行業(yè)的重要元素，采用發(fā)酵法進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)，有利于提高生產(chǎn)過(guò)程的效率，保證最終生產(chǎn)質(zhì)量。生產(chǎn)環(huán)節(jié)的損耗減少，也不會(huì)對(duì)周?chē)h(huán)境造成影響，具有綠色節(jié)能的特點(diǎn)。今后發(fā)酵法在硫酸軟骨素生產(chǎn)中應(yīng)用，也必將會(huì)成為一種有效工藝。