杜若桑

(首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069)

針刺動物實(shí)驗(yàn)在研究針刺起效機(jī)制、經(jīng)穴特異性等方面發(fā)揮了重要作用，應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動物也有多種,如大小鼠、兔、貓、豬甚至靈長類動物猴等。有統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)針刺研究類文獻(xiàn)中14%為動物實(shí)驗(yàn)，其中應(yīng)用最多的實(shí)驗(yàn)動物是大鼠(占60.47%)[1]。究其原因，是因?yàn)榇笫蠛腿祟愐粯佣际遣溉閯游铮浠蚪M與人類高度相似,而且大鼠生長發(fā)育成熟快、繁殖力強(qiáng)、體型較小和飼養(yǎng)成本低，其遺傳學(xué)特征較為一致，對實(shí)驗(yàn)條件的反應(yīng)也較為近似，可作為多種人類疾病模型。迄今為止，雖然大鼠針刺實(shí)驗(yàn)已被廣泛開展，但在這些實(shí)驗(yàn)研究中作為基本操作的大鼠腧穴定位和針刺時(shí)大鼠固定的方法仍存在一些問題，如取穴不準(zhǔn)確和固定不牢固，勢必干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)度、影響研究的準(zhǔn)確性和可信度，本研究試討論之。

1 大鼠腧穴的定位方法

腧穴是針刺的施術(shù)部位，通過刺激穴位才能發(fā)揮治療作用，準(zhǔn)確定位腧穴是針刺起效的前提。準(zhǔn)確定位腧穴是大鼠實(shí)驗(yàn)中重要的一環(huán)，是實(shí)驗(yàn)成功與否的重要保障[2-4]。人體上的腧穴經(jīng)過上千年不斷的理論整理歸納和臨床實(shí)踐驗(yàn)證，已經(jīng)較為成熟。中獸醫(yī)學(xué)也積累了關(guān)于牛、馬等腧穴定位主治和刺灸的經(jīng)驗(yàn)，但大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物中的一種，其腧穴理論是建國后20世紀(jì)50年代后期隨著針灸動物實(shí)驗(yàn)發(fā)展起來的，雖短短幾十年，卻有了一定的積累,但仍存在不少問題和爭議。

根據(jù)華興邦等[2]于上世紀(jì)90年代制定的大鼠穴位圖譜，大鼠穴位數(shù)量是42個(gè)，隨著大鼠針刺實(shí)驗(yàn)的不斷開展，越來越多的腧穴在大鼠身上被定位與應(yīng)用。總的來說，目前確定的大鼠腧穴絕大多數(shù)是臨床常用的十四經(jīng)穴，除此之外有少部分經(jīng)外奇穴，如八邪、八風(fēng)等。這些腧穴的定位方法和依據(jù)主要有以下3種。

1.1 參照人類腧穴定位

根據(jù)比較解剖學(xué)、比較生理學(xué)，不同物種的解剖構(gòu)造、生理生化有一定的相似性，據(jù)此人類的部分腧穴可以投射到動物身上，動物穴位可參照人體穴位的定位方法如體表標(biāo)志法、骨度折量寸法定位[5]。但畢竟大鼠和人類的體型、解剖結(jié)構(gòu)等仍存在明顯差異，所以參照人類腧穴定位法時(shí)還應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)動物自身形態(tài)特點(diǎn)來確定穴位的具體位置，例如大鼠合谷穴在前肢第1、2掌骨之間，與人類合谷穴定位方法一致；涌泉穴位于后肢掌心前正中，與人類定位接近[2]。但人類的腧穴已經(jīng)過無數(shù)的實(shí)踐驗(yàn)證，而大鼠腧穴不能只簡單地比照人類腧穴定位，而需要進(jìn)一步的研究來確定其特異性。

1.2 參照中獸醫(yī)學(xué)中穴位定位方法

中獸醫(yī)學(xué)已積累總結(jié)了牛、馬、貓、狗等動物的腧穴標(biāo)準(zhǔn)和刺灸經(jīng)驗(yàn)，但大鼠這一嚙齒類動物屬于實(shí)驗(yàn)動物，它并不在傳統(tǒng)中獸醫(yī)學(xué)范圍內(nèi)[6]。有一些大鼠腧穴是通過模仿大型家畜或貓狗而來，比如大鼠的尾尖穴(位于尾部尖端)、膝前穴(位于膝蓋骨正前方)，此類腧穴為動物特有的,在人體上沒有相對應(yīng)的腧穴[2]。目前應(yīng)用到大鼠的針刺實(shí)驗(yàn)研究一般是利用大鼠腧穴對應(yīng)人類腧穴，繼而開展針刺療效或機(jī)制等研究，所以這些動物特有的腧穴在針刺動物實(shí)驗(yàn)研究中極少涉及。

1.3 根據(jù)腧穴的特異性確定穴位

腧穴尤其是經(jīng)穴具有特異性，即腧穴有特異性治療效應(yīng)[7]：經(jīng)穴與非穴點(diǎn)之間主治功能上存在差異,另外穴位點(diǎn)和非穴點(diǎn)相比，前者具有可被客觀檢測到的生物物理、化學(xué)特性(如穴位具有低電阻、高電位的特性)[8],抑或組織結(jié)構(gòu)上有差異(腧穴的特異性研究進(jìn)展),穴位的這些特異性表現(xiàn)也是實(shí)驗(yàn)動物穴位定位的關(guān)鍵因素，由此可以通過對比療效差異、技術(shù)手段檢測等確定穴點(diǎn)和非穴點(diǎn)。劉佳玉等[9]利用聲測經(jīng)絡(luò)技術(shù)發(fā)現(xiàn)大鼠腧穴聲波波幅值明顯高于旁開2 mm的非穴點(diǎn)，這說明大鼠腧穴和人類腧穴一樣具有高導(dǎo)聲特性。但在動物身上應(yīng)用此法定穴時(shí)宜和上述其他定位法配合，如參考人類腧穴定穴后在穴位周圍選取非穴點(diǎn)，兩者相比較進(jìn)行特異性評估。

1.4 討論

目前某些大鼠腧穴的定位還有分歧，比如高頻用穴足三里的定位方法超過7種[1]，其中最為公認(rèn)的定位是位于腓骨小頭下5 mm[2]，但金建華等[10]認(rèn)為此穴在腓骨頭下0.82 mm處：首先參照人體骨度折量寸確定大鼠足三里位于此，繼而通過甩尾疼痛測試發(fā)現(xiàn)針刺此處可取得良好的鎮(zhèn)痛效果，這是根據(jù)足三里鎮(zhèn)痛這一特異性療效確認(rèn)了這一定位的準(zhǔn)確性。而另外一項(xiàng)國外的研究認(rèn)為大鼠足三里位于膝關(guān)節(jié)下6.5 mm、脛骨前肌上，同樣利用穴位的特異性效應(yīng)，通過觀察足三里對醋酸誘導(dǎo)腹痛的鎮(zhèn)痛效果驗(yàn)證得出[11]。對于此種分歧，筆者認(rèn)為還是應(yīng)該利用腧穴的特應(yīng)性效應(yīng)，通過臟腑-經(jīng)穴效應(yīng)實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)足三里的定位。除了上述鎮(zhèn)痛療效外，其最主要的作用是調(diào)理脾胃，可通過制造脾胃病模型觀察確認(rèn)大鼠足三里的準(zhǔn)確位置。

鄭利巖等[12]根據(jù)穴位點(diǎn)的導(dǎo)電量較大、聲波波幅值較高和高導(dǎo)聲的特性，在與人體經(jīng)穴相仿處確定了大鼠腧穴46個(gè)，其中部分經(jīng)穴亦經(jīng)過經(jīng)穴-臟腑效應(yīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證治療作用[13]。但其中和《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[14]中定位一致的穴位僅有5個(gè)，其余32個(gè)均有所不同。這提示應(yīng)對現(xiàn)流行的大鼠腧穴定位進(jìn)行檢驗(yàn)考證，進(jìn)一步對穴位的位置進(jìn)行尋找確定。目前3種常見的大鼠腧穴定位方法各有優(yōu)劣，確定大鼠腧穴定位時(shí)不能只根據(jù)上述1種方法，而是應(yīng)將各種方法綜合起來確定腧穴的位置。例如,可以先結(jié)合大鼠自身解剖結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，按照人類腧穴比照定穴，然后利用腧穴特有治療效應(yīng)或物理化學(xué)特性等特異性特征驗(yàn)證確定。

另外,某些穴位定位描述簡單粗略，不能很好地指導(dǎo)取穴，比如神闕位于臍中央，關(guān)元在臍下約25 mm處，中脘在臍上20 mm處，這些穴位均以肚臍為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)[2]。但大鼠的肚臍在離乳前無法辨認(rèn)，嚴(yán)重影響尋找這些位于腹正中線上的任脈腧穴，上述腧穴的定位描述中卻未給出更詳細(xì)的取穴指導(dǎo)，未說明如何尋找大鼠肚臍，這勢必影響實(shí)驗(yàn)中針刺操作者取穴的準(zhǔn)確度[15]。所以應(yīng)進(jìn)一步細(xì)化穴位定位的描述，給出盡量具體的取穴指導(dǎo)。除此之外，現(xiàn)有的大鼠穴位圖譜為高度概括的平面圖，在指導(dǎo)定穴方面有很大的局限性[2]。因穴位圖譜可以更直觀地呈現(xiàn)腧穴的位置，有利于提高研究者定位的準(zhǔn)確性。因此，應(yīng)在精確穴位定位的基礎(chǔ)上，利用不斷更新的繪圖技術(shù)，繪制立體、準(zhǔn)確、清晰和詳細(xì)的穴位圖譜。

2 針刺時(shí)大鼠固定方法

大鼠和人類不同，不能主動接受針刺治療。另外，針刺具有一定的刺激性和致痛性，大鼠易被激惹繼而攻擊抓撓咬傷實(shí)驗(yàn)人員，威脅實(shí)驗(yàn)人員的健康安全，亦會影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，進(jìn)而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差增大、實(shí)驗(yàn)可信度降低。因此針刺施術(shù)時(shí)如何固定大鼠使其順利地完成治療是實(shí)驗(yàn)操作中重要的一環(huán)。而現(xiàn)在流行的大鼠固定器往往以尾靜脈注射或取血等為目的，一般只暴露出大鼠尾部，暴露面積有限，不適用于針刺治療，因?yàn)檠ㄎ槐椴即笫笕?，針刺時(shí)往往需要選取身體多個(gè)部位的多個(gè)穴位；另外針刺時(shí)往往需要留針一段時(shí)間，這些都提示針刺實(shí)驗(yàn)對大鼠固定方法的要求更高，需要在牢固固定大鼠一段時(shí)間的基礎(chǔ)上還要充分暴露出被針刺的腧穴。目前針刺時(shí)常見的大鼠固定方法有麻醉固定法、高臺固定法、捆綁束縛固定法、鼠套固定法和其他裝置固定法。

2.1 麻醉固定法

即麻醉動物后再行針刺治療，此時(shí)大鼠處于麻醉狀態(tài)，針刺施術(shù)不會引起動物的反抗，可順利實(shí)施治療。但麻醉藥物有致死風(fēng)險(xiǎn)，除此藥物在起到麻醉作用的同時(shí)對機(jī)體還有其他影響，如異氟烷能引起認(rèn)知功能障礙[16-17]；戊巴比妥鈉和氯胺酮對大鼠呼吸有一定的抑制作用，前者還會抑制血壓[18]；長效麻醉劑烏拉坦毒性大且有較強(qiáng)致癌性，還會造成血糖升高[19]。麻醉藥的這些特性會影響實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度。

2.2 捆綁束縛固定法

即利用橡皮筋、繩索和醫(yī)用膠帶等捆綁束縛大鼠四肢后再將其固定于鼠臺上，這種方法可使大鼠身體充分伸展，大鼠暴露面積大，肢體、背部或腹部都可充分暴露。但捆綁會引起大鼠反抗掙扎，有可能造成束縛脫落大鼠逃脫進(jìn)而固定失??；另外捆綁過緊的話會造成被捆綁遠(yuǎn)端部分缺血紫脹，時(shí)間過長時(shí)甚至?xí)斐芍w缺血壞死。

2.3 高臺固定法

此法利用了大鼠恐高的特性。王宇[20]利用此特性將大鼠置于表面積為6 cm×12 cm、距地面50 cm高的木制高臺上，大鼠即會由于怕高而不敢活動。將高臺固定的糖尿病大鼠和束縛固定的糖尿病大鼠相比較，發(fā)現(xiàn)相對于束縛固定，高臺固定法對血糖影響不明顯，說明此法能有效地減少束縛應(yīng)激對疾病模型和針刺效應(yīng)的影響。但是高臺固定法也有應(yīng)用限制：上述研究提到大鼠在高臺上自然呈趴臥，此時(shí)針刺大鼠頭背部、四肢外側(cè)的穴位較為方便，但其他部位暴露不充分不便于針刺。另外此法仍存在大鼠被激惹的可能性，此種情況下加上大鼠未被強(qiáng)制固定導(dǎo)致施術(shù)者被抓傷咬傷的風(fēng)險(xiǎn)仍較大。

2.4 鼠套固定法

用較為透氣的布料(以利于大鼠呼吸)制作鼠套，鼠套大小依據(jù)大鼠身形大小制作。因大鼠喜暗喜鉆洞，鼠套后端開口供大鼠鉆入；前端是大鼠頭部所在處，在大鼠四肢對應(yīng)的位置上開小孔，大鼠鉆入鼠套后將其四肢由小孔處掏出固定。由于處于黑暗的環(huán)境中，所以大鼠較為安靜，利于針刺操作。本法操作簡單安全，可充分暴露大鼠四肢，尤其適合針刺四肢部腧穴，對于背部腧穴可在相應(yīng)位置剪開小口后針刺。曹朝霞等[21]設(shè)計(jì)了前后開口的圓柱體布套，待大鼠的頭伸出固定器前口時(shí)收緊系帶，大鼠軀干及四肢處于布套內(nèi)，此時(shí)可對大鼠頭面部及雙下肢進(jìn)行針刺操作。這兩種鼠套由于并未牢固固定大鼠頭部和四肢，有可能針刺后大鼠活動幅度較大造成針具脫落。王建波等[22]利用襪子制作襪套套在大鼠頭部及上肢處，襪套上開兩個(gè)孔將上肢掏出，然后用雙手分別從大鼠兩側(cè)腋下穿過，固定大鼠上肢并用拇指固定住大鼠的頭部。最后用橡皮筋將大鼠的四肢分別固定在兔臺上。但這種方法需要兩個(gè)人配合,另外橡皮筋綁縛較緊會造成血流不暢、遠(yuǎn)端肢體充血紫脹，不適合長時(shí)間的固定。

2.5 其他裝置固定法

李洋洋等[23]用金屬絲網(wǎng)制作固定筒，再配合可固定大鼠四肢、封閉身體固定筒出入口U型叉固定大鼠，大鼠身體暴露充分，這樣任何部位的腧穴都可被針刺。但是該固定器初次固定大鼠時(shí)會引起大鼠應(yīng)激掙扎反應(yīng)。另外固定后的大鼠四肢仍有一定的活動，還有大鼠頭部固定存在問題，當(dāng)大鼠頸部固定棒的交叉點(diǎn)過高容易導(dǎo)致大鼠窒息，過低則不能很好地固定頭部。

2.6 討論

目前大鼠固定方法雖然較多但都存在暴露部位少、激惹大鼠、固定效果不穩(wěn)定與單人操作不便等問題，仍需進(jìn)一步研究出固定效果好、操作方便的固定方法以提高大鼠針刺治療配合度。另外固定方法也應(yīng)符合動物倫理原則，如3R原則中優(yōu)化(refine)原則：優(yōu)化實(shí)驗(yàn)程序以減少對動物的傷害，盡量讓動物處于舒適狀態(tài)[24]。還有不論任何固定方法都不能排除引起大鼠應(yīng)激反應(yīng)的可能性，如將大鼠置于高臺可誘發(fā)其應(yīng)激反應(yīng)，引起血漿中皮質(zhì)酮水平和海馬中乙酰膽堿升高，但是其他大鼠應(yīng)和針刺組大鼠一樣被固定或設(shè)立固定對照組，以觀察排除固定方法對實(shí)驗(yàn)的影響[25]。

3 小結(jié)

從20世紀(jì)50年代針刺基礎(chǔ)研究開展后，實(shí)驗(yàn)動物腧穴應(yīng)運(yùn)而生，迄今為止已取得了諸多成果和進(jìn)步，已經(jīng)形成了較為規(guī)范、認(rèn)可度高的腧穴定位標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)理論[26]，如現(xiàn)在較通用的定位標(biāo)準(zhǔn)是華興邦[2]等制定的大鼠穴位圖譜，其涵蓋了制定當(dāng)時(shí)大鼠針刺實(shí)驗(yàn)研究中常用的穴位，但隨著越來越多針刺動物實(shí)驗(yàn)的開展，涉及的腧穴越來越多，其中有些穴位未被收錄，如應(yīng)用頻率很高的上巨虛穴[27]，還有風(fēng)池、神庭[28]、次髎和血海[29]。但有關(guān)大鼠腧穴定位研究數(shù)量較少，另外還存在穴位定位方法不一且穴位位置有一定偏差[3]的問題，總之大鼠腧穴定位標(biāo)準(zhǔn)亟需更新，目前動物腧穴標(biāo)準(zhǔn)化已得到重視，相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)正在研究制定中[26]。

針刺時(shí)大鼠固定的好壞關(guān)系著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程順利與否，也直接影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至可決定實(shí)驗(yàn)的成敗，迄今如何在針刺過程中良好地固定大鼠尤其是固定清醒大鼠仍無令人滿意的方法。如何固定大鼠是任何一位開展針刺大鼠實(shí)驗(yàn)的研究者都會遇到的問題，但是這方面的研究仍較少，筆者搜索到目前已有不少大鼠針刺固定器的專利產(chǎn)品[30-33]，更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)有更好地固定大鼠以減少其應(yīng)激反應(yīng)且安全性高、針刺部位暴露充分等優(yōu)勢，但很多裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜且只見圖紙不見實(shí)物，希望其中優(yōu)秀的設(shè)計(jì)能轉(zhuǎn)化為具體產(chǎn)品，供針灸研究者使用。