許藝元，李志剛，王巧俠，秦萍萍，劉瀟瀟

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

抑郁癥是一種長(zhǎng)時(shí)間的持久性情緒低落，伴失眠焦慮甚至出現(xiàn)自殺傾向的精神疾患[1]。目前對(duì)抑郁癥的研究仍停留在假說(shuō)階段，其中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子假說(shuō)和神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)和基因轉(zhuǎn)錄假說(shuō)占有重要地位[2]。慢性應(yīng)激是誘導(dǎo)抑郁發(fā)生的主要原因，而海馬作為應(yīng)激遞質(zhì)分泌的靶區(qū)域，是參與應(yīng)激反應(yīng)的最重要腦區(qū)之一[3]。本實(shí)驗(yàn)選取大鼠海馬內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)及5-羥色胺(5- hydroxy tryptamine，5-TH)作為研究指標(biāo)，通過(guò)建立抑郁模型，觀測(cè)電針前后大鼠的行為學(xué)變化以及海馬內(nèi)BDNF、5-TH的影響，從而探索電針對(duì)抑郁癥的治療機(jī)制及影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 免疫組化相關(guān)試劑與儀器 無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);EDTA抗原修復(fù)液(武漢博士德生物工程有限公司);雙氧水(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);牛血清白蛋白V(北京索萊寶生物公司);PBS(武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司);BDNF一抗(ab108319，美國(guó)abcam公司);5-HT一抗(ab66047，美國(guó)abcam公司);脫水機(jī)(JT-12S，武漢俊杰電子有限公司);包埋機(jī)(JB-P7，武漢俊杰電子有限公司);病理切片機(jī)(RM2235，德國(guó)徠卡);凍臺(tái)(JB-L7，武漢俊杰電子有限公司);烤片機(jī)(DB-B2，常州國(guó)華電器有限公司);烤箱[101-1BS，邦西儀器科技(上海)有限公司];搖床(SK-R1807-E，美國(guó)賽洛捷克);混勻儀(MX-S，美國(guó)賽洛捷克);倒置顯微鏡(Nikon Ci-S，日本尼康);成像系統(tǒng)(Nikon DS-U3，日本尼康)。

1.1.2 ELISA相關(guān)試劑與儀器 大鼠BDNF ELISA 檢測(cè)試劑盒(MB-1750A，江蘇酶標(biāo)生物);5-HT ELISA檢測(cè)試劑盒(MB-1983A，江蘇酶標(biāo)生物);超凈臺(tái)(SW-CJ-2，江蘇蘇州); 微量加樣器(Refe-rence，德國(guó) eppendorf);微量振蕩器(MH-2，上海楚柏);烘箱(Venticell，德國(guó)MMM);酶標(biāo)儀(EXL800，美國(guó)Bio-Tek)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠32只，體質(zhì)量300～350 g，實(shí)驗(yàn)環(huán)境相對(duì)室溫(23±1)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，自然晝夜節(jié)律光照，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水?dāng)z食，12 h白天-黑夜循環(huán)飼養(yǎng)。

1.3 模型建立

采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)的方式，防止大鼠對(duì)一種或多種規(guī)律的應(yīng)激刺激產(chǎn)生耐受性。正常組采取群養(yǎng)，其他各組采取孤養(yǎng)，并進(jìn)行21 d每天隨機(jī)8種不同的應(yīng)激刺激，包括4℃冷水游泳5 min、晝夜顛倒24 h、禁食24 h、禁水24 h、夾尾3 min、水平搖晃30 min、籠位傾斜45° 24 h和潮濕環(huán)境24 h等刺激，平均每種刺激3次。

1.4 動(dòng)物分組

清潔、健康級(jí)雄性SD大鼠32只根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、模型組、電針組和藥物組，每組各8只。

1.5 各組飼養(yǎng)及干預(yù)方法

1.5.1 正常組 群養(yǎng)，正常飼養(yǎng)，不接受任何刺激。

1.5.2 模型組 孤養(yǎng)，接受慢性應(yīng)激處理21 d，不給予任何治療性刺激及抗抑郁劑。

1.5.3 電針組 孤養(yǎng)，接受慢性應(yīng)激處理21 d。每日于應(yīng)激刺激1 h后將大鼠置于自制鼠套(前半部透明網(wǎng)紗，后半部黑色)內(nèi)進(jìn)行電針治療。電針治療方法：治療采用一次性針灸針(0.30 mm×25 mm，華佗牌，蘇州針灸器械廠)進(jìn)行針刺，穴位選用百會(huì)穴(GV20)、印堂穴(GV29)與雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴(PC6)，穴位定位參照全國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》。針刺GV20時(shí)，針尖朝向大鼠后頭部斜刺2 mm，針刺GV29針尖向鼻尖方向斜刺5 mm ，實(shí)驗(yàn)中為避免因兩針位置太近針柄相接而短路，于兩針柄間放置消毒脫脂棉球。針刺完成后分別于雙側(cè)PC6間、GV20與GV29間接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，電針頻率2/100 Hz，電流強(qiáng)度為1 mA，以動(dòng)物肢體微顫為度，每次治療持續(xù)20 min。

1.5.4 藥物組 孤養(yǎng)，接受慢性應(yīng)激處理21 d，每日于應(yīng)激刺激1 h后予百優(yōu)解灌胃(劑量：2 mg/kg，1次/d，生理鹽水1 mL稀釋)。

1.6 高架十字迷宮測(cè)試

大鼠每組8只，21 d造模后做行為學(xué)檢測(cè)。自制高架十字迷宮(High plus maze，HPM)：由兩條相對(duì)開(kāi)放臂(50 cm×10 cm)和兩條相對(duì)閉合臂(50 cm×10 cm，臂兩側(cè)有40 cm高擋板)及中央?yún)^(qū)(10 cm×10 cm)連接而成，離地高70 cm。將大鼠放入十字迷宮的中央格，保持向閉合臂，記錄5 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。觀察大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)以及在開(kāi)放臂的停留時(shí)間、閉合臂的進(jìn)入次數(shù)及閉合臂停留時(shí)間；計(jì)算比較各組大鼠在開(kāi)放臂的停留時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)的百分比。開(kāi)放臂停留時(shí)間百分比為大鼠在開(kāi)放臂停留時(shí)間與在開(kāi)放臂和閉合臂停留的總時(shí)長(zhǎng)之比；開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)比為大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)與進(jìn)入開(kāi)放臂和閉合臂的總次數(shù)之比。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)

高十字架迷宮測(cè)試后，在各組大鼠中隨機(jī)抽取6只，10%水合氯醛富強(qiáng)麻醉。腹主動(dòng)脈采血，室溫靜止1～2 h，4200 rmp離心10 min，取上清，-80℃保存，備用。按照檢測(cè)BDNF及5-TH 的 ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，于波長(zhǎng)450 nm酶標(biāo)儀上讀值，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為樣品濃度，以此繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。并根據(jù)血清樣品的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對(duì)應(yīng)的濃度。

1.8 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

各組動(dòng)物快速斷頭取腦，去除顱骨，充分暴露腦組織，快速剝離海馬組織，放入4%多聚甲醛液中固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋和熱修復(fù)，免疫組化備用。BDNF及5-TH的測(cè)定采用免疫組化SP法。具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)視野，之后計(jì)算每高倍鏡(200×)下積分光密度值(Integral optical density，IOD)。BDNF的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物主要集中在胞質(zhì)及核膜周圍區(qū)域，呈棕黃色絲狀物；5-TH則主要在神經(jīng)元包質(zhì)包膜著色，呈黃褐色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

高架十字迷宮是國(guó)際上公認(rèn)的經(jīng)典測(cè)量焦慮反應(yīng)的方法，大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)及在開(kāi)放臂的停留時(shí)間與其焦慮情緒成負(fù)相關(guān)[4]。如表1所示，與正常組相比，模型組大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)比及處于開(kāi)放臂時(shí)間比明顯降低，組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組大鼠焦慮行為明顯強(qiáng)于正常組，提示抑郁模型造模成功。與模型組相比，藥物組和電針組進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)比及時(shí)間比明顯升高，組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明用電針、藥物進(jìn)行干預(yù)后，大鼠的焦慮癥狀明顯改善。與藥物組相比，電針組大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)比更高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明電針在改善大鼠抑郁焦慮行為癥狀時(shí)，一定程度上優(yōu)于藥物組。

表1 高架十字迷宮中行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2 電針對(duì)外周血與海馬中BDNF和5-TH含量的影響

ELISA結(jié)果顯示，模型組外周血中BDNF、5-HT含量明顯低于正常組，組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。藥物組和電針組BDNF、5-HT含量明顯高于模型組，組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

免疫組化結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組海馬BDNF、5-HT表達(dá)明顯降低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，藥物組和電針組BDNF、5-TH表達(dá)均明顯升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與藥物組相比，電針組中BDNF與5-HT的表達(dá)都稍高，一定程度表明電針對(duì)于抑郁模型大鼠的治療效果更加顯著。見(jiàn)表3、圖1和圖2。

表2 各組大鼠外周血清中BDNF與5-HT含量結(jié)果

表3 各組大鼠海馬中BDNF與5-HT表達(dá)結(jié)果

圖1 各組大鼠海馬組織BDNF表達(dá)(免疫組化，200×)

圖2 各組大鼠海馬組織5-TH表達(dá)(免疫組化，200×)

3 討論

抑郁癥在中醫(yī)學(xué)中與“郁證”“梅核氣”“癲證”“臟躁”等病癥相關(guān)。其作為一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，作用機(jī)制較為復(fù)雜，且臨床藥物治療也面臨著副作用大等問(wèn)題。多名學(xué)者研究顯示：針刺治療抑郁癥具有實(shí)施方便、適用患者群體廣泛、副作用小、安全度高與成本低等優(yōu)勢(shì)[5-9]。本實(shí)驗(yàn)選取電針療法以增強(qiáng)毫針針刺的刺激量并最大限度地減小由施針者不同或同一施針者不同情態(tài)下施針而造成的誤差。其基于針灸的經(jīng)絡(luò)腧穴理論，從整體上疏通經(jīng)絡(luò)，促進(jìn)氣血運(yùn)行，以促進(jìn)患者自身陰陽(yáng)平衡，從而治愈抑郁癥導(dǎo)致的一系列癥狀；且電針治療在改善抑郁患者生理癥狀的同時(shí)，注重調(diào)整其內(nèi)在精神情緒狀態(tài)，達(dá)到雙管齊下的目的。

BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子假說(shuō)中的重要研究成分，可調(diào)節(jié)神經(jīng)功能及可塑性，尤其是對(duì)海馬的神經(jīng)發(fā)生具有極其重要的促進(jìn)作用[10]。Taliaz D等[11]學(xué)者認(rèn)為 BDNF 的減少可使海馬體積縮小，海馬內(nèi)神經(jīng)元及周圍膠質(zhì)細(xì)胞減少。

5-TH主要分布在中腦中縫核群，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)分泌的重要神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)元的分化與再生[12]。Ferraro G等[13]學(xué)者認(rèn)為，反復(fù)持續(xù)應(yīng)激刺激可引起海馬結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，造成海馬神經(jīng)元的缺失，抑制中縫核內(nèi)5-TH、DA等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，出現(xiàn)抑郁癥狀。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑郁癥發(fā)病與治療過(guò)程中大鼠海馬與外周血清當(dāng)中BDNF與5-HT的含量變化一致，且無(wú)明顯變化幅度的差異，據(jù)此可以猜測(cè)BDNF與5-TH兩個(gè)途徑具有某種相關(guān)性。

電針可對(duì)BDNF及5-TH兩個(gè)系統(tǒng)均產(chǎn)生良性干預(yù)，由此可印證電針對(duì)抑郁癥具有多層次、多靶點(diǎn)的綜合調(diào)節(jié)作用，且因其具有良好的耐受性、安全性等特點(diǎn)，為抑郁癥的臨床治療方案提供了新的選擇。今后筆者將繼續(xù)探索BDNF與5-HT兩條通路的具體聯(lián)系以及電針對(duì)抑郁大鼠模型的時(shí)效性。