張晨新,曲 怡,王建波,張立德

(遼寧中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥創(chuàng)新工程技術中心，遼寧 沈陽 110847)

作為心腦血管疾病中發(fā)病率及死亡率極高的病種，原發(fā)性高血壓在臨床上的發(fā)病率呈現逐年增高的趨勢，因高血壓引起的心、腦和腎的靶器官損傷已經成為威脅正常人體健康的重要因素之一[1]。血壓的異常增高而導致的微血管損傷是高血壓靶器官主要發(fā)病機制。近年來，血管內皮損傷是高血壓疾病的主要研究熱點[2]，尋找能逆轉血管內皮功能的治療方式對于逆轉高血壓靶器官損傷有著重要意義。既往對Ghrelin研究均集中于調節(jié)胃腸激素分泌、增強胃黏膜防御、調節(jié)胃動力功能和增強胃運動活動等方面[3-5]，然而Ghrelin對于血管內皮的保護作用鮮有報道。最新研究表明Ghrelin與血壓密切相關，GHSR在心臟、腎臟和血管中的高表達為Ghrelin在血壓調節(jié)提供了證據，Ghrelin濃度與血壓呈負相關[6]。因此，調節(jié)Ghrelin濃度對保護高血壓內皮功能具有重要的意義。

足三里具有顯著降壓效果，臨床Meta分析文獻證實，常用降壓穴位中，足三里的使用頻次高達30.6%[7]。中醫(yī)將高血壓歸屬為“眩暈”“頭痛”“不寐”等范疇，其針刺治療依據中醫(yī)辨證論治選穴配方。足三里為足陽明胃經穴位，陽明經屬多氣多血之經，而足三里作為“合穴”“合主逆氣而泄”，針刺足三里具有“泄氣血”之功。因此，在臨床采用針灸治療高血壓配穴時，常選用該穴，并達到了良好的治療效果。本實驗擬從胃動力密切相關Ghrelin入手探討針刺足三里調節(jié)Ghrelin保護內皮細胞的作用，部分闡釋了足三里“泄”的機理，為臨床針刺降壓提供實驗依據。對豐富中醫(yī)內涵、拓寬臨床醫(yī)生診療思維具有重要意義。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SHR大鼠30只、WKY大鼠10只，大鼠體質量在(200±10 g)左右[許可證號：SCXK(京)2019-0011]。動物購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。本實驗在遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心進行，實驗過程中嚴格按照無菌操作標準，保障大鼠SPF級生存環(huán)境。

1.2 主要儀器

華佗牌針灸針(0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；ABI Veriti梯度PCR儀(Applied Biosystems)；超微量紫外分光光度計(Thermo，nano-drop 2000)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System)；SpectraMax i3多功能酶標儀(奧地利)；VE-386半干轉移電泳槽(上海天能)；EPS-600電泳儀(上海天能)；VE-180垂直電泳槽(上海天能)；數碼凝膠圖像處理系統(上海天能)。

1.3 主要試劑

ET-1 E1isa試劑盒(Bejing Cheng Lin Biological Technology Co.，Lot.201905)；Ghrelin E1isa試劑盒(Bejing Cheng Lin Biological Technology Co.，Lot.201905)；PCR反轉試劑盒(康為世紀，Lot 40326)；PCR擴增試劑盒(康為世紀，Lot 60407)；Trizol總RNA抽提試劑(Beyotime，Lot R0061)；PCR引物(博邁德引物合成公司)；DEPC水配制，0.2mL DEPC與200 mL超純水混合，分裝后過夜，高壓滅菌；RIPA組織/細胞裂解液(Solarbio，Lot.No.20190418)；PMSF(Solarbio，Lot.No.20190505)；PVDF膜(Membrane，Lot.K5EA7920A)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime Lot No.P0012S)；SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒(Beyotime，Cat No.P0012AC)；5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(凱基生物，Lot No.051319190513)；Marker(凱基生物，Lot.20171113)；β-actin Mouse Monoclonal Antibody(Absci，Lot.5814)；GHS-R1 antibody(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，Lot.L0214)；eN0S Mouse Monoclonal Antibody(Abcam，Lot.4023); HRP*Goat Anti-Mouse IgG(Immuno Way，Catalog No:RS0001)；HRP*Goat Anti -Rabbit IgG(ImmunoWay，Catalog No:RS0002)；HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(E030120-01)；ECL (Beyotime，Lot:P0018S)；引物合成(北京博邁德基因技術有限公司)。

2 方法

2.1 分組和造模

選用雄性SHR大鼠30只，隨機數字表法分為模型組(10只)、針刺組(10只)和非經非穴組(10只)，WKY大鼠(10只)作為空白組。SHR大鼠收縮壓均>150 mmHg。

2.2 取穴與針刺方法

針刺組選取大鼠雙側足三里穴(穴位定位參考《實驗針灸學》)進行針刺治療[8-9]，用0.25 mm×13 mm毫針針刺“足三里”穴，穴位位于大鼠雙側膝關節(jié)外側、腓骨小頭下3.5 mm處；非經非穴組針刺鼠尾作為非經非穴點，以毫針直刺5 mm即可。針刺療程共7 d。

2.3 取材

大鼠在針刺結束后，禁食24 h，禁食期間自由飲水，然后進行取材工作。按照大鼠體質量注射10%水合氯醛麻醉，麻醉劑量為0.3 mL/100 g。大鼠麻醉后，腹主動脈取血，離心取血清，將血清置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。取血結束后，剔出胸主動脈組織于無菌EP管中，凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 觀察指標及檢測方法

2.4.1 熒光定量PCR檢測GHSR、eNOS mRNA表達 取大鼠主動脈組織100 mg，用Trizol法萃取提取mRNA。經過濃度與純度測定后，調整mRNA濃度進行逆轉錄反應，將mRNA反轉為cDNA并用ROX熒光體系進行擴增，反應總體系為20 μL(擴增條件：95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；40個循環(huán))。擴增使用PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2.4.2 使用Elisa法檢測ET-1、Ghrelin濃度 取主動脈組織100 mg，加入1 mL PBS與研磨珠進行勻漿(3 000 r，15 min)。離心后收取上清液。在96孔板上設置好空白孔、標準品孔以及待測樣品孔。不同孔分別加入不同濃度的標準品以及待測樣品各50 μL；每孔加入50 μL酶標試劑，封口孵育30 min；洗滌后加入顯色劑A，B各50 μL，封口封口孵育30 min；加入終止液50 μL，用酶標儀測定每孔OD值(450 nm波長)；用標準孔數值繪制y=ax+b回歸線，用公式計算主動脈ET-1、Ghrelin濃度。

2.4.3 Western Blot檢測不同組別大鼠主動脈eNOS、GHSR蛋白表達 取胸主動脈組織100 mg，加入1 mL RIPA裂解液進行勻漿，離心取上清液。用BCA法測定上清液中總蛋白濃度并進行濃度調整。配置凝膠進行電泳，每孔上樣50 μg進行電泳。電泳結束后用半干轉的方式進行轉膜，將蛋白質轉移到0.22的PVDF膜上。封閉37 ℃，1 h；加入一抗，4 ℃過夜；TBST清洗；加入二抗，37 ℃ 1 h；TBST清洗。加入ECL發(fā)光液，在數碼凝膠成像系統進行檢測。分析條帶灰度值進行數據統計。

2.5 統計學處理

統計分析采用SPSS 21.0進行數據分析。統計結果數據采用均數±標準差表示。組間分析使用單因素方差分析的統計分析方法，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 不同組別大鼠主動脈組織GHSR、eNOSmRNA表達比較

由表2、圖1可知，與空白組比較，模型組和非經非穴組大鼠主動脈組織GHSR、eNOS mRNA表達明顯下調(P<0.05)；與模型組相比，針刺組大鼠主動脈組織GHSR、eNOS mRNA表達顯著上調(P<0.05)，非經非穴組差異無統計學意義(P<0.05)。

表2 不同組別大鼠胸主動脈GHSR、eNOS mRNA表達變化比較

圖1 不同組別大鼠胸主動脈GHSR、eNOS mRNA溶解與擴增曲線

3.2 不同組別大鼠血清ET-1、Ghrelin表達

由表3可見，模型組、針刺組和非經非穴組大鼠主動脈組織ET-1、Ghrelin含量與空白組比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)；針刺組主動脈組織ET-1、Ghrelin含量與模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。非經非穴組主動脈組織ET-1、Ghrelin含量與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 不同組別大鼠血清ET-1、Ghrelin表達變化比較

3.3 不同組別大鼠胸主動脈eNOS、GHSR表達

各組大鼠主動脈組織的蛋白表達比較由圖2、表4可知，與空白組相比，模型組和非經非穴組大鼠主動脈組織eNOS、GHSR蛋白表達明顯下調(P<0.05)；與模型組相比，針刺組大鼠主動脈組織eNOS、GHSR蛋白表達顯著上調(P<0.05)，非經非穴組差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 不同組別大鼠胸主動脈eNOS、GHSR灰度值變化

圖2 不同組別大鼠胸主動脈eNOS、GHSR表達

4 討論

原發(fā)性高血壓是由于遺傳、環(huán)境等多種因素相互作用，導致體循環(huán)動脈壓增高的一種疾病[10]。在高血壓的發(fā)生發(fā)展過程中，可以造成心、腦、腎和循環(huán)系統等器官的損害，且高血壓是最常見的心血管疾病之一。目前研究表明,高血壓發(fā)病的主要原因是全身細小動脈的持續(xù)性痙攣硬化，導致全身循環(huán)阻力增加，從而引起血壓上升,而心血管疾病的一個早期病理改變即為血管內皮功能受損[11]，原發(fā)性高血壓發(fā)病的重要機制之一就是血管內皮功能障礙。主動脈內皮屬于血液與血管平滑肌之間的一層屏障，能夠有效地抵抗炎癥物質入侵，阻礙脂質物質沉淀，另外內皮還可以釋放NO維持血管舒縮功能的穩(wěn)態(tài)。當高血壓病內皮功能受到損害，內皮完整性受到破壞的時候，會引起心血管重塑和動脈粥樣硬化等疾病，大多數學者認為誘發(fā)許多心腦血管疾病的共同環(huán)節(jié)是由內皮細胞結構損傷與功能紊亂導致。血管內皮功能的重要性使其成為心血管疾病的1個基本靶點和調節(jié)點，血液的流動性和抗血栓形成功能依賴于內皮功能的完整性。內皮釋放的體液因子可以控制纖維蛋白溶解和血栓形成、血小板激活和抑制、血管舒張和收縮，內皮細胞釋放的縮血管物質主要有ET-1、血栓素A2(TXA2)和血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)，NO、前列環(huán)素(PGI2)是內皮細胞主要釋放的擴血管物質。這些血管活性物質的水平直接反映了內皮功能是否正常。

Ghrelin是一種主要由胃和小腸產生的含28個氨基酸的多肽[12]，是生長激素分泌激素受體(GHSR)的內源性配體，GHSR在心臟、腎臟和血管中均有表達[13]，Ghrelin主要是由X/A樣細胞產生，通過旁分泌的方式進入血液循環(huán)[14]，Ghrelin及其受體在人類微血管內皮細胞中有表達，Ghrelin亦可改善血管內皮功能， 抑制炎癥因子[15]。GHSR對心血管系統有保護作用，這也間接證明了Ghrelin在高血壓發(fā)病機制和血壓調節(jié)上起到了關鍵的作用。體外研究表明Ghrelin能通過抑制ET-1的分泌、增加eNOS的合成，促進NO的釋放，引起血管的舒張[16]。Ghrelin亦可通過降低eNOS的表達直接誘導NO的合成擴張血管來保護血管內皮功能、降低血壓[17]。Ghrelin可以激活內皮或者直接作用于血管平滑肌，導致血管舒張、降低血壓[18]。本研究結果證實，模型組大鼠與空白組相比血清中Ghrelin、ET-1的含量升高，胸主動脈GHSR、eNOS mRNA表達下降，胸主動脈eNOS、Ghrelin蛋白量下降，說明Ghrelin水平與高血壓血管內皮功能密切相關。

中醫(yī)學無高血壓這一病名，常將此病歸屬于“眩暈”“頭痛”的范疇。目前本病主要以藥物治療為主， 針灸作為非藥物療法具有毒副作用小、操作簡便的特點，且對原發(fā)性高血壓病療效確切，并且廣泛應用于臨床。但其機制尚不清楚，本研究采用多氣多血的陽明經穴位足三里進行針刺治療，研究該針刺組穴對于血管內皮的生理機能產生的影響，以期發(fā)現針刺治療肥胖性高血壓的作用靶點與機制。高血壓是由于陰陽失調、氣機運行異常和臟腑經絡等功能失調引起，以血壓升高作為可以監(jiān)測的臨床癥狀體征，并伴隨著頭暈、頭痛等臨床表現。而這些癥狀大多是由于腦小動脈痙攣，這種動脈痙攣又與高血壓息息相關，動脈痙攣繼而發(fā)生腦動脈硬化、腦供血不足等病理改變，會使患者病情更為嚴重。高血壓的中醫(yī)病因病機應從血脈論治，且多數醫(yī)家認為內皮功能障礙應從“心主血脈”論治。足三里首見于《靈樞·本輸》，歸屬足陽明胃經，為胃經合穴，又為胃腑之下合穴，具有調和氣血、補益中氣和健脾和胃的作用。足三里穴作為主穴用于高血壓病能有效地降低高血壓大鼠的血壓，而對心率無影響。多數醫(yī)者認為針刺足三里對正常的血壓無降低作用，只是對異常升高的血壓有降低效用，此降壓作用是由于外周血管的擴張所致。因此，本實驗選取此穴作為降壓治療的主穴。針刺足三里可以達到平穩(wěn)、安全降壓的目的，降低了高血壓病對靶器官損害的風險，預防心腦血管事件的發(fā)生。同時，現代臨床最常用于降壓的經驗穴之一就是胃經合穴足三里[19]。研究表明針刺足三里可以通過調節(jié)內皮細胞分泌功能從而達到降低血壓的目的[20]。本研究結果顯示，針刺足三里能明顯改善SHR大鼠血清Ghrelin、ET-1水平和胸主動脈GHSR、eNOS mRNA及eNOS和GHSR的蛋白表達，針刺足三里可能通過調節(jié)Ghrelin和血管內皮活性物質水平來保護SHR大鼠血管內皮功能。以上研究通過探索針刺干預保護血管的通路，揭示了部分針刺足三里治療原發(fā)性高血壓的作用靶點，也為Ghrelin在血管內皮損傷中的作用提供了一定依據，一定程度上解釋了針刺足三里對高血壓機體的保護作用機制。從實驗方面研究針刺對原發(fā)性高血壓的防治不僅為高血壓的針刺治療提供了有力的證據，還對減緩高血壓人群的疾病進程以及提高患者生活質量有重大意義。