劉璐(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031)

0 引言

隨著人們生活水平的提高，食物的豐富程度與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也越來(lái)越高，但心腦血管疾病的發(fā)生率也不斷上升。納豆菌在納豆發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一種絲氨酸蛋白酶，其學(xué)名被稱為納豆激酶，具有高效的溶血酸活性。納豆激酶具有高效的溶血栓活性，可以降低心腦血管疾病的發(fā)生率，在越來(lái)越重視養(yǎng)生生活的今天，有極高的應(yīng)用價(jià)值。以蕎麥為發(fā)酵底物，通過(guò)納豆菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶在近年來(lái)成為主要趨勢(shì)之一。這是由于蕎麥的碳水化合物含量較高，且礦物元素、蛋白質(zhì)、維生素以及膳食纖維的含量較高，適合納豆菌的生長(zhǎng)發(fā)育，且蕎麥的成本較低，還含有較為多的蘆丁等黃酮類化合物，生物活性較強(qiáng)且具備較好的抗氧化性，對(duì)于心腦血管疾病也具備較好的防治效果，與納豆激酶可以共同作用，增強(qiáng)效能。因此，以蕎麥為發(fā)酵底物通過(guò)納豆菌液態(tài)發(fā)酵，不僅可以產(chǎn)生納豆激酶而且可以有效提高發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性，該方法的發(fā)酵效率高。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：納豆菌、蕎麥、大豆分離蛋白、凝血酶、纖維蛋白原、BCA 試劑盒、AAPH、熒光素、Trolox、大豆蛋白胨、胰酶、NS37071、復(fù)合蛋白酶、α-淀粉酶(10000U/g)、福林酚試劑。

儀器：VarioskanFlash 型酶標(biāo)儀、UV-721型紫外分光光度計(jì)、LRH-250A-Ⅱ生化培養(yǎng)箱、SKY-211B 恒溫培養(yǎng)振蕩器、BioStatB2.5L 發(fā)酵罐。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 瓶條件

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.5%、氯化鈉1%、酵母粉0.5%，200mL/500mL 錐形瓶，PH7.0。

種子液的制?。喝≡嚬苤斜４娴募{豆菌在種子培養(yǎng)基中接種，保持溫度37℃條件下，以轉(zhuǎn)速為180r/min 連續(xù)振蕩培養(yǎng)20h。

蕎麥糖化液培養(yǎng)基：浸泡蕎麥6h 以上，然后以1:10的料液比進(jìn)行加水打漿，分為6組分別加入不同含量的α-淀粉酶，為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%，然后以90℃的溫度同時(shí)加熱40分鐘，制取6組蕎麥糖化液發(fā)酵培養(yǎng)基，并將pH 調(diào)到7.0。

大豆分離蛋白酶解物：將大豆分離蛋白以1:15的料液比加去離子水，并充分?jǐn)嚢?，使大豆分離蛋白完全水化，分為3組，并分別加入大豆分離蛋白含量1.5%的胰酶、NS37071、復(fù)合蛋白酶，然后在55℃條件下，分別酶解4h、8h 和12h，酶解完成后用沸水浴滅酶活性，最后在4℃條件下以8000r/min 離心15min，取上清液經(jīng)減壓、濃縮、冷凍、干燥等流程制取大豆分離蛋白酶解物。

對(duì)比研究條件分別為α-淀粉酶添加量、補(bǔ)充氮源和發(fā)酵時(shí)間：

(1) α-淀粉酶添加量對(duì)比：取6組蕎麥糖化液培養(yǎng)基分別接種2%的種子液，在溫度為37℃的條件下，以180r/min 連續(xù)振蕩培養(yǎng)24h，對(duì)比研究α-淀粉酶添加量不同的情況下納豆激酶生產(chǎn)率的情況。

(2)補(bǔ)充氮源的對(duì)比：去不同的大豆分離蛋白酶解物和商業(yè)蛋白胨，以4%的比例加入到蕎麥糖化液培養(yǎng)基中，在溫度為37℃、pH 為7.0的條件下以180r/min 連續(xù)振蕩培養(yǎng)24h，對(duì)比研究補(bǔ)充氮源不同的情況下納豆激酶生產(chǎn)率的情況。

(3)發(fā)酵時(shí)間：將大豆酶解物加入到蕎麥糖化液培養(yǎng)基中，分為5組分別在溫度為37℃、pH 為7.0的條件下以180r/min 連續(xù)振蕩培養(yǎng)0h、12h、24h、36h、48h，對(duì)比研究不同發(fā)酵時(shí)間的情況下納豆激酶生產(chǎn)率的情況。

1.2.2 發(fā)酵條件

發(fā)酵條件主要研究發(fā)酵罐通氣量、轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量等條件對(duì)納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥產(chǎn)納豆激酶的影響。取上述制得的接種后的培養(yǎng)基，置入2.5L 發(fā)酵罐中，在37℃條件下設(shè)置以下對(duì)比條件進(jìn)行研究：(1)通氣量對(duì)比實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為2.0L/min、3.0L/min 和4.0L/min；(2)轉(zhuǎn)速對(duì)比實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為200r/min、300r/min 和400r/min；(3)裝液量對(duì)比實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為1L、1.5L和2L；(4)接種量對(duì)比實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為2.0%、2.5%和3.0%。

1.2.3 發(fā)酵罐中菌體生長(zhǎng)和代謝特性分析

在取得優(yōu)化后的發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中利用pH電極和復(fù)膜氧電極實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵罐中的pH 值變化和氧含量變化，并且每隔8h 取樣分析，分別測(cè)定生物量、納豆激酶活力、可溶性蛋白含量、還原糖含量、總酚含量、氧自由基吸收能力。

(1)生物量的測(cè)定：生物量測(cè)定主要采用細(xì)胞干重法，主要過(guò)程為取用20mL 發(fā)酵液，在4℃條件下以8000r/min 離心15min，收集離心后的物質(zhì)，并使用生理鹽水洗滌趕緊，然后在105℃條件下用干燥皿徹底烘干，最后稱取重量，計(jì)算生物量。

(2)可溶性蛋白的測(cè)定：可溶性蛋白測(cè)定使用BCA 試劑盒進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)選取牛血清蛋白濃度。

(3)還原糖的測(cè)定：還原糖測(cè)定使用DNS 法進(jìn)行測(cè)定，即3,5-二硝基水楊酸比色法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析主要采用SPSS25.0軟件，當(dāng)P＜0.05為顯著差異，表明研究結(jié)果具有對(duì)比價(jià)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶條件優(yōu)化結(jié)果

(1)α-淀粉酶添加量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果：生物體的生長(zhǎng)和發(fā)育離不開(kāi)碳水化合物，在納豆菌的培養(yǎng)過(guò)程中，碳源的來(lái)源非常重要。不同的碳源生物體的利用率不同，菌體生長(zhǎng)發(fā)育利用的碳源主要為麥芽糖或葡萄糖，在菌體生長(zhǎng)發(fā)育中利用淀粉作為碳源時(shí)需要先將其水解水麥芽糖或者葡糖糖。α-淀粉酶可以快速的水解淀粉，將其水解為麥芽糖和麥芽三糖，然后進(jìn)一步將麥芽三糖再水解為麥芽糖和葡萄糖。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，添加有α-淀粉酶的蕎麥糖化液其納豆菌生產(chǎn)納豆激酶的活力較高。因此，添加α-淀粉酶可以有效提高納豆菌生產(chǎn)納豆激酶的活力和產(chǎn)量，但是對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加有α-淀粉酶的蕎麥糖化液培養(yǎng)基中，納豆菌生產(chǎn)納豆激酶的活力有明顯的先升高后下降趨勢(shì)，這一趨勢(shì)在α-淀粉酶添加量為0.6%、0.8%、1%的蕎麥糖化液培養(yǎng)基中隨濃度的升高，變化趨勢(shì)與變化速率越明顯，而α-淀粉酶添加量為0.2%的蕎麥糖化液培養(yǎng)基中，其納豆菌生產(chǎn)納豆激酶的活力升高趨勢(shì)雖然比未添加α-淀粉酶的蕎麥糖化培養(yǎng)基速率快，但是相比其他幾組則速率較慢，而下降趨勢(shì)則不明顯，其中α-淀粉酶添加量為0.4%的蕎麥糖化液培養(yǎng)基，納豆菌生產(chǎn)納豆激酶的活力不僅升高速度較快，且在之后保持了較為平穩(wěn)的態(tài)勢(shì)。造成這一現(xiàn)象的原因是，雖然葡萄糖是易吸收的速效碳源，但是當(dāng)其含量過(guò)高時(shí)會(huì)產(chǎn)生阻遏作用，影響納豆菌生產(chǎn)納豆激酶的活力，而在α-淀粉酶添加量為0.4%的蕎麥糖化液培養(yǎng)基中，α-淀粉酶分解淀粉的速率適中，可以供納豆菌較好的利用，因此其可以有效提高納豆菌生產(chǎn)納豆激酶的活力。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶添加量為0.4%時(shí)納豆菌生產(chǎn)納豆激酶的活性最高。

(2)補(bǔ)充氮源對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果：納豆菌在使用大豆蛋白胨作為氮源時(shí)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的活性較高，這是基于其選著性決定的。在利用其它氮源時(shí)納豆菌可以正常生長(zhǎng)但是生產(chǎn)納豆激酶的活性較低。大豆蛋白胨是由大豆蛋白水解后形成的一種肽類和氨基酸形成的混合物，可利用程度較高，可以有效提高納豆菌的吸收速率和納豆激酶的生產(chǎn)活性。但是大豆蛋白胨的價(jià)格較高，且缺少安全性的食品級(jí)蛋白胨。

(3)發(fā)酵時(shí)間對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果：發(fā)酵時(shí)間可以影響納豆激酶的生產(chǎn)活力，在發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，納豆激酶的生產(chǎn)活性會(huì)不斷提高，但是當(dāng)其到達(dá)峰值后，如果繼續(xù)發(fā)酵則會(huì)限制酶活性，造成酶活性下降。這是由于納豆激酶產(chǎn)量到達(dá)峰值后，如果繼續(xù)發(fā)酵，則會(huì)造成納豆菌種群含量過(guò)高，而由于空間不足，從而造成能量消耗過(guò)大，影響納豆激酶的生產(chǎn)活力。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時(shí)間為36h 時(shí)，納豆激酶的產(chǎn)率到達(dá)峰值，之后會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，納豆激酶的產(chǎn)率逐漸降低，因此36h 為最為合理的發(fā)酵時(shí)間。

2.2 發(fā)酵罐發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

納豆菌是典型的好氧細(xì)菌，較高的氧含量有助于提高納豆激酶的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

(1)通氣量的提高可以增加發(fā)酵罐中的氧含量，通氣量較低時(shí)，納豆激酶的活性較低；而通氣量較高時(shí)，納豆激酶的活性較高，但會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵罐起泡。對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)通氣量為3.0L/min時(shí)，可以較好的兼顧酶活性與氣泡程度；

(2)攪拌速度也可以提高發(fā)酵罐中的溶氧量，提高納豆激酶的生產(chǎn)活性，但是攪拌速度過(guò)高會(huì)傷害納豆菌群，造成菌體發(fā)育速度下降。對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)攪拌速度為300r/min 時(shí)可以較好的提高納豆激酶的生產(chǎn)活性同時(shí)保證納豆菌群的發(fā)育；

(3)裝液量過(guò)高或過(guò)低都不利于納豆菌群的發(fā)育，這是由于裝液量過(guò)低生產(chǎn)原料不足，而裝液量過(guò)高，空間過(guò)小會(huì)影響溶氧量，對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)裝液量為1.5L 時(shí)較為理想；

(4)接種量決定了納豆菌群的發(fā)育速度，接種量過(guò)低則納豆菌群的發(fā)育速度較慢，難以及時(shí)進(jìn)行生產(chǎn)，而接種量過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致納豆菌群的發(fā)育速度過(guò)快，造成資源消耗過(guò)快，有害物質(zhì)的積累過(guò)快。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種量為2.5%時(shí)，納豆菌群的發(fā)育情況較為理想，納豆激酶的生產(chǎn)活力較高。

2.3 發(fā)酵罐中菌體生長(zhǎng)和代謝特性分析

通過(guò)前文的分析可知，在搖瓶條件下，商業(yè)大豆蛋白胨與NS37071-12h 制取的大豆蛋白酶解物生產(chǎn)納豆激酶的活力沒(méi)有明顯的差異。但是由于兩者的水解度、混合物組成以及分子情況均有所差異，在發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)時(shí)，兩者可能會(huì)出現(xiàn)差異，以下對(duì)此進(jìn)行分析：

(1)氮源對(duì)生物量影響：兩者進(jìn)行添加后均沒(méi)有明顯的延滯期。商業(yè)蛋白胨的整體生物量增長(zhǎng)較快，24h 達(dá)到最大生物量5.81g/L。大豆分離蛋白酶解物的整體生物量較前者慢，但是對(duì)數(shù)期較長(zhǎng)，30h 達(dá)到最大生物量6.68g/L。相比而言，雖然商業(yè)蛋白胨的生物量增長(zhǎng)更快，但是后期增長(zhǎng)率不足，生物量總體上較大豆分離蛋白酶解物的含量更低。

(2)氮源對(duì)還原糖的影響：實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，商業(yè)蛋白胨前期的還原糖消耗較快，但是24h 基本停止，而大豆分離蛋白酶解物的前期還原糖含量消耗較慢，但是直到36h 后還原糖消耗才逐漸停止，證明了納豆菌群的增長(zhǎng)與還原糖的消耗成一定的關(guān)系。

3 結(jié)語(yǔ)

本文對(duì)以蕎麥為發(fā)酵底物，通過(guò)納豆菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化研究，分析其代謝特性。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納豆菌群的增長(zhǎng)與還原糖的消耗成一定的關(guān)系，36h 為最為合理的發(fā)酵時(shí)間。接種量為2.5%時(shí)，納豆菌群的發(fā)育情況較為理想，納豆激酶的生產(chǎn)活力較高。