李秋鴻，黃清松，毛建文

(廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006)

人胚胎干細胞(hESCs)來源于人囊胚內細胞團，在體外培養(yǎng)時具有自我更新和多向分化的潛能，其體外分化的過程可再現(xiàn)早期胚胎發(fā)育的各個階段[1-3]。定型內胚層細胞是包括甲狀腺、肺、胰腺、肝臟和腸道在內等器官的胚胎前體[4]。不管是脊椎動物的體內胚胎發(fā)育還是人多能干細胞的體外定向分化，定型內胚層的產(chǎn)生都必須依賴于TGF-β/nodal/activin信號通路的激活[5]。該信號通路的激活往往伴隨著細胞遷移運動的發(fā)生，細胞運動是一個非常復雜的過程，表現(xiàn)為細胞形態(tài)、黏附和遷移能力等方面的變化[6-9]。在體外，將人胚胎干細胞定向分化為定型內胚層[10]或中胚層[11]的過程中都可以檢測出與細胞運動有關的表面蛋白表達發(fā)生變化，例如E-cadherin、N-cadherin等。在胚胎發(fā)育過程中，鋅指蛋白SNAIL家族的激活能夠促進細胞發(fā)生遷移運動[12]，體外定型內胚層細胞運動能力的獲得與SNAIL家族之間的關系目前報道較少。為了研究SNAIL家族在定型內胚層分化過程中的作用，本實驗通過干擾SNAI1基因的表達，探討SNAI1與定型內胚層命運及與細胞運動之間的關系。

1 材料

1.1 細胞

人胚胎干細胞細胞株H1購于威斯康星州WiCell研究所(Wicell,Madison,WI)。

1.2 主要試劑

mTeSR1培養(yǎng)基(Stemcell Technologies)；Matrigel基底膠(BD Biosciences)；Accutase細胞消化液(Sigma)；RPMI/B27培養(yǎng)基(Gibco)；激活素A(Peprotech)； FBS (HyClone)；DAPI(Sigma)；FOXA2抗體(R&D system)；小鼠來源的SNAI1單克隆抗體(Cell Signaling Technology)；HRP標記的羊抗兔二抗、Alexa Fluor?488 標記的驢抗羊二抗(Invitrogen)；Trizol試劑(MRC)；ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO)；SYBR Premix Ex Taq Kit(TAKARA)；western化學顯色試劑盒(MILLIPORE)；siSNAI1-1#(銳博生物)；siSNAI1-2#(銳博生物)；轉染試劑Lipofectamine RNAiMAX(Thermo scientific)。

1.3 主要儀器

Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss)；CFX96 Touch實時熒光定量PCR儀 (美國Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將人胚胎干細胞系H1接種于鋪有Matrigel基底膠的6孔板上，加入mTeSR1培養(yǎng)基在37 ℃、5%(φ)CO2的條件下培養(yǎng)，每天換液。當培養(yǎng)板中細胞密度較大時，按照1∶4～1∶6的比例用Accutase細胞消化液進行傳代。

2.2 定型內胚層分化

在24孔板中提前半小時預先鋪好Matrigel基底膠，將6孔板中密度達50%左右的H1細胞用Accutase消化液進行消化，細胞密度以第2天細胞接近鋪滿整個培養(yǎng)孔為宜。細胞貼壁成功并鋪滿整個培養(yǎng)孔后加入含有50 ng/mL Activin A重組蛋白的RPMI/B27培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)3 d，每天更換新鮮的分化培養(yǎng)基[13]。

2.3 siRNA轉染

嚴格按照轉染試劑 Lipofectamine RNAiMAX 說明書的操作步驟進行。

2.4 Western blot檢測siRNA對SNAI1蛋白的干擾效果

收集細胞并裂解蛋白進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，用脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗人SNAI1多克隆抗體，4 ℃條件下孵育過夜，TBS /T清洗3次，加入相對應的HRP標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBS/T清洗3次，滴加顯影液和定影液于暗室中顯影成像。

2.5 qRT-PCR檢測FOXA2、GATA4/6、KLF8、TGFβ1、SNAI1等基因的表達

將在24孔板中培養(yǎng)的H1細胞向內胚層定向誘導3 d后，吸棄培養(yǎng)基上清液，用PBS緩沖液清洗3次，每孔中加入約1 mL Trizol試劑，反復吹打直至細胞完全溶解。加入氯仿分層，取水相至預冷的異丙醇中獲得總RNA沉淀，洗滌晾干，將RNA沉淀重新溶于蒸餾水，測定濃度。根據(jù)ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書操作，取2 μg總RNA將其反轉為cDNA并適度稀釋，用作PCR模板。采用SYBR Premix Ex Taq Kit進行qPCR反應，內參為GAPDH。所用引物的序列如下：FOXA2，5′-ACTACCCCGGCTACGGTTC-3′(正向)，5′-AGGCCCGTTTTGTTCGTGA-3′(反向);GATA4，5′-CGACACCCCAATCTCGATATG-3′(正向)，5′-GTTGCACAGATAGTGACCCGT-3′(反向)；GATA6，5′-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3′ (正向)，5′-GTC GAGGTCAGTGAACAGCA-3′(反向)；KLF8，5′-CCCAAGTGGAACCAGTTGACC-3′(正向)，5′-GAC GTGGACACCACAAGGG-3′(反向)；TGFβ1，5′-CTAATGGTGGAAACCCACAACG-3′(正向)，5′-TATCGC CAGGAATTGTTGCTG-3′(反向)；SNAI1，5′-ACTGCA ACAAGGAATACCTCAG-3′(正向)，5′-GCACTG GTACTTCTTGACATCTG-3′(反向);GAPDH，5′-AGG GCTGCTTTTAACTCTGGT-3′(正向)，5′-CCCCACTTG ATTTTGGAGGGA-3′ (反向)。

2.6 免疫熒光檢測FOXA2蛋白的表達

4%多聚甲醛固定細胞，處理30 min后用PBS清洗3次，然后加入0.3% Triton X-100/PBS溶液通透30 min，PBS清洗3次，加入10% FBS/PBS溶液室溫孵育1 h。加入羊抗人BFOXA2一抗于4 ℃冰箱中孵育過夜，PBS清洗3次，加入相對應的Alexa Fluor?488 標記的驢抗羊免疫熒光二抗，避光孵育2 h，PBS清洗3次，加入DAPI避光孵育5 min，PBS清洗3次,封片。使用Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡進行觀察和拍照。

2.7 細胞遷移運動能力檢測

采用劃痕法測定內胚層定向分化第3天的細胞遷移運動能力：用無菌針頭快速劃過單層培養(yǎng)的細胞表面，形成無細胞區(qū)，該區(qū)域附近的細胞可以向無細胞區(qū)遷移運動，拍照、測量起始的無細胞區(qū)的邊界距離，然后將細胞放置回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再取出拍照、測量無細胞區(qū)邊界距離，由此可計算出細胞24 h內的遷移距離。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 驗證siSNAI1的干擾效果

將hESCs誘導為內胚層細胞的過程中加入干擾SNAI1表達的siRNA，與正常對照相比，分化第3天細胞內SNAI1基因的mRNA含量顯著下降(P<0.01)，見圖1。通過蛋白免疫印跡法也證實分化第3天內胚層細胞中SNAI1蛋白的表達受到明顯抑制，見圖2。

0123t/d0.00200.00150.00100.00050.0000相對表達量NCsiSNAI1-1siSNAI1-2SNAI1**

與siSNAI1-1組、siSNAI1-2組比較：**P<0.01。

圖1分化過程中經(jīng)siSNAI1處理后細胞內SNAI1基因的mRNA含量

Figure1Gene expression ofSNAI1 after siSNAI1 treatment in endoderm differentiation

3.2 干擾SNAI1基因的表達對FOXA2表達的影響

在內胚層細胞分化過程中，F(xiàn)OXA2在分化第2天左右就會發(fā)生上調，分化第3天在細胞中高表達。阻礙SNAI1基因的表達導致FOXA2在第2天左右上調失敗(P<0.05)，直接影響分化第3天FOXA2在細胞中的表達量(P<0.05)，結果見圖3。細胞免疫熒光檢測分化第3天細胞內FOXA2蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，siRNA處理的細胞幾乎不表達FOXA2，說明細胞的內胚層分化命運受到抑制，見圖4。

0123SNAI1GAPDH

1. hESCs; 2. siSNAI1-1 D3; 3. siSNAI1-2 D3; 4. NC D3。

圖2經(jīng)siSNAI1處理后細胞內SNAI1蛋白含量

Figure2IntracellularSNAI1 protein content after siSNAI1 treatment

0123t/dNCsiSNAI1-1siSNAI1-2FOXA20.0160.0120.0080.0040.000相對表達量**

與siSNAI1-1組、siSNAI1-2組比較：*P<0.05。

圖3分化過程中經(jīng)siSNAI1處理后細胞表達FOXA2的情況

Figure3Expression ofFOXA2 mRNA in siSNAI1-treated cells during endodermal differentiation

圖4經(jīng)siSNAI1處理3 d后細胞表達FOXA2蛋白的情況

Figure4Expression of FOXA2 protein in siSNAI1-treated cells at 3 days

3.3 干擾SNAI1基因的表達對GATA4、GATA6、TGFβ1、KLF8 mRNA表達的影響

為了進一步驗證SNAI1基因的表達受阻對內胚層細胞命運的影響，利用實時熒光定量PCR檢測細胞中GATA4、GATA6的mRNA表達情況發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比，siRNA處理的細胞中內胚層標記基因GATA4、GATA6的表達非常低(P<0.01)。同時qRT-PCR結果還表明與細胞運動相關的基因TGFβ1、KLF8的表達也受到影響(P<0.01)，見圖5。

0.00040.00030.00020.000100.0040.0030.0020.0010相對表達量0.0120.0100.0080.0060.0040.0020相對表達量0.000250.000200.000150.000100.000050GATA4GATA6TGFβ1KLF8NCD3siSNAI1-1siSNAI1-2****************

與NC組比較：**P<0.01。

圖5經(jīng)siSNAI1處理3 d后細胞表達GATA4、GATA6、TGFβ1、KLF8的情況

Figure1Expression ofGATA4、GATA6、TGFβ1 andKLF8 mRNA in siSNAI1-treated cells at 3 days

3.4 干擾SNAI1基因的表達對細胞遷移運動能力的影響

如圖6所示，將hESCs誘導為內胚層細胞的過程中，細胞會獲得遷移運動能力，細胞由上皮狀態(tài)轉變?yōu)殚g充質狀態(tài)。加入干擾SNAI1表達的siRNA后，細胞的遷移運動能力受到明顯限制(P<0.01)。

****siSNAI1-2D3siSNAI1-1D3NCD3400300200100024h遷移距離/?m

與NC組比較：**P<0.01。

圖6經(jīng)siSNAI1處理3 d后細胞遷移運動能力的變化

Figure6Cell migration assay after siSNAI1 treatment at 3 days

4 討論

原腸胚期是動物胚胎發(fā)育過程中的一個重要階段，此時外、中、內3個胚層開始出現(xiàn)，盡管內胚層細胞的數(shù)量在胚胎總細胞數(shù)中占比不高[14]，但是卻能夠產(chǎn)生機體中的大部分內臟器官。盡管這些內臟器官在形態(tài)和功能上存在差異，但它們的形成都與細胞的遷移運動密不可分[15]。SNAI1對于細胞的運動至關重要，干擾SNAI1的表達會導致細胞形態(tài)、功能發(fā)生改變，甚至是遷移運動能力的喪失[16- 17]。研究發(fā)現(xiàn)SNAI1敲除的小鼠胚胎無法正常出生，推測可能與原腸胚期細胞遷移運動過程受阻有關[18]，而在小鼠的胚胎干細胞(mESCs)中異位過表達SNAI1則會促進細胞發(fā)生遷移運動[19]。

胚胎干細胞是由囊胚內細胞團衍生而來，能夠分化為內、中、外原始三胚層來源的多種類型的細胞，是未來細胞治療的重要資源。然而干細胞真正的臨床研究進展緩慢，其應用還存在不少安全問題，這主要是由于人們對分化過程的本質及機制的認識還非常有限[20]。以內胚層分化為例，研究發(fā)現(xiàn)將人胚胎干細胞定向分化為內胚層細胞的過程中可以觀察到細胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，這些細胞還具有與體內分化細胞相似的遷移運動能力，盡管細胞運動與其命運之間有何聯(lián)系尚不清楚。

本實驗利用RNA干擾技術，通過抑制SNAI1的表達，探討SNAI1對定型內胚層分化過程的影響及其在細胞遷移運動中所起的作用。實驗結果發(fā)現(xiàn)干擾SNAI1的表達會阻礙內胚層的定向分化過程，定型內胚層譜系命運轉變過程嚴重受阻，分化的細胞幾乎不表達定型內胚層的標志蛋白，同時與細胞運動有關的基因表達明顯下調，細胞的遷移運動能力有限。由此說明SNAI1不僅在定型內胚層分化過程中起著決定細胞命運的作用，還能夠阻止細胞獲得相應的遷移運動能力。推測細胞獲得遷移運動能力可能是人胚胎干細胞成功分化為定型內胚層細胞的前提。