馬麗霞 高玉娟 劉曉慧 張晶

肝細(xì)胞凋亡參與了多種急慢性肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、膽汁淤積性肝病和肝臟缺血-再灌注損傷等，是肝細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一[1-2]。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， Fas配體、腫瘤壞死因子-ɑ、放線菌D(actinomycin D，AcD)、干擾素、四氯化碳等常見的肝毒性藥物可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡[3]。隨著研究的深入，相繼發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸、蛋白水解酶抑制劑、角質(zhì)細(xì)胞生長因子等，可抑制肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生[4-5]，但其作用機(jī)制尚未完全闡明，且臨床應(yīng)用還很少。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)作為一種神經(jīng)遞質(zhì)的小單胺分子，對肝臟的病理生理起著至關(guān)重要的作用，它可以促進(jìn)多種嚙齒動(dòng)物部分肝切除術(shù)后的肝臟再生，促進(jìn)缺血/再灌注損傷后的肝組織修復(fù)[6，7]。研究發(fā)現(xiàn)，5-HT還能夠通過抑制小鼠肝細(xì)胞凋亡，改善對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷[8]。肝細(xì)胞損傷與細(xì)胞凋亡的關(guān)系非常密切。到目前為止，5-HT在AcD誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡過程中的作用尚不清楚。本研究探討5-HT在AcD誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡過程中的作用及其可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用5-HT制劑治療肝臟疾病提供依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞、材料和試劑

人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞和正常細(xì)胞系7702細(xì)胞(美國ATCC公司)；DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Hyclone公司)，AcD、5-HT、MTT工作液(美國Sigma公司)，5-HT 2A受體激動(dòng)劑2，5-二甲氧基4一碘苯基丙烷(2，5-dimethoxy 4-iodophenyl- 2-aminopropane，DOI)、5-HT 2B受體激動(dòng)劑α-甲基血清素馬來酸鹽(α-Methylser otoninmal- eate salt，M110)、5-HT 2B受體拮抗劑N-1-甲基-5-吲哚基-5-三唑基(N-1-methyl-5-indolyl -5-isothazolyl urea，SB204)(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC流式檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；TUNEL試劑盒(德國羅氏公司)；抗肌動(dòng)蛋白(β-actin)(立陶宛Fermentas公司)；PVDF膜(美國Bio-Rad公司)；兔抗人蛋白水解酶3(proteolytic enzymes 3，caspase3)單克隆抗體、DAPI熒光染料(美國Abcam公司)；兔抗人絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，AKT)單克隆抗體、兔抗人磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(phosphorylation serine/threonine protein kinase， p-AKT)單克隆抗體(美國Epitomics公司)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7702細(xì)胞，分別在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取一部分對數(shù)期的兩種細(xì)胞，即傳代后細(xì)胞密度生長至80 %左右時(shí)，Hank′s液洗滌細(xì)胞，加入少量0.25%胰酶消化1～2 min，分別加入各自培養(yǎng)基輕柔吹打成單個(gè)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取1.5×105個(gè)細(xì)胞鋪種于6孔板中，培養(yǎng)體系為2 mL，孵育24 h細(xì)胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)基，分別換為2 mL無血清培養(yǎng)基，各加入25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD，每組3個(gè)復(fù)孔，分別孵育24 h后收集細(xì)胞為第1.1部分。將另一部分37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件下孵育的處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞消化吹散后細(xì)計(jì)數(shù)，取1.5×105個(gè)細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，孵育過夜待細(xì)胞貼壁后改為無血清培養(yǎng)，每孔加入50 ng/mL AcD預(yù)處理30 min后，分別給予100 μmol 5-HT、100 μmol 5-HT 2B受體激動(dòng)劑M110、100 μmol 5-HT 2A受體激動(dòng)劑DOI、100 μmol 5-HT 2B受體拮抗劑SB204+100 μmol 5-HT，每組6個(gè)復(fù)孔，各孵育24 h后收集細(xì)胞為第1.2部分。

三、細(xì)胞凋亡檢測

采用AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測，取1.1和1.2部分收集的各組細(xì)胞置于15 mL離心管，1 000 r/min(r=13.5 cm)離心5 min，棄上清；用4℃預(yù)冷的1×PBS洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后，1 000 r/min(r=13.5cm)離心5 min；棄上清，用1×PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；取1.5×105個(gè)重懸細(xì)胞，放入新的流式管中，1 000 r/min(r=13.5 cm)離心5 min，棄上清；每管加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min；1 000 r/min(r=13.5 cm)離心5 min，棄上清，每管加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，再加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。上流式細(xì)胞儀檢測：每實(shí)驗(yàn)組收集細(xì)胞1.5×105個(gè)，不足1.5×105個(gè)細(xì)胞組收集全部，F(xiàn)L1為FITC，F(xiàn)L2為PI，上機(jī)檢測。

四、細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測

采用TUNEL法，取1.1部分收集的各組細(xì)胞分別加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然干燥，盡量使細(xì)胞單層吸附到載玻片上，甲醛固定30 min，PBS浸洗2次，每次5 min。將吸附細(xì)胞的載玻片在0.2% Triton X-100中處理15 min，PBS浸洗2次。參照TUNEL試劑盒說明書制備TUNEL反應(yīng)混合液，將TdT與熒光素標(biāo)記的dUTP液按1∶10比例混勻，將反應(yīng)液滴加適量于細(xì)胞上，37℃孵育1 h，加入50 μL converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片避光后37℃反應(yīng)30 min，使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)將TUNEL陽性細(xì)胞染色并用蘇木精復(fù)染色，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照記錄。

五、細(xì)胞存活率檢測

采用MTT法，①取一部分處于對數(shù)期的HepG2和7702細(xì)胞吹打成單個(gè)后細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5×103個(gè)細(xì)胞鋪種于96孔板中，培養(yǎng)體系為200 μL，孵育24 h細(xì)胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)基，分別換為200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基，各加入25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD，每組3個(gè)復(fù)孔，分別孵育24 h。②取另一部分處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞消化吹散后細(xì)計(jì)數(shù)，5×103個(gè)細(xì)胞鋪種于96孔板中，培孵育過夜待細(xì)胞貼壁后改為無血清培養(yǎng)，每孔加入50 ng/mL AcD預(yù)處理30 min后，分別給予100 μmol 5-HT 、100 μmol 5-HT 2B受體激動(dòng)劑M110、100 μmol 5-HT 2A受體激動(dòng)劑DOI、100 μmol 5-HT 2B受體拮抗劑SB204+100 μmol 5-HT，每組6個(gè)復(fù)孔，各孵育24 h。向以上兩部分的細(xì)胞中各加入20 μL 5 mg /mL MTT，37℃溫育5 h。棄上清，每孔加入DMSO溶液150 μL溶解沉淀，振蕩器振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光值并記錄結(jié)果。

六、細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測

采用蛋白質(zhì)印跡法，取1.2部分收集的各組細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒說明書步驟提取蛋白，消化、離心收集處理，加入裂解液于4℃冷庫搖床上裂解20 min，12 000 r/min (r=13.5 cm)4℃離心20 min，提取上清液即為蛋白溶液。BCA法進(jìn)行蛋白定量，將蛋白濃度調(diào)節(jié)到8 μg/μL，分裝后-80℃保存，避免反復(fù)凍融。配置SDS-PAGE凝膠，分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用相應(yīng)的第一抗體孵育(兔抗人caspase3單抗、AKT單抗、p-AKT單抗比例均為1∶1 000，β-actin比例為1∶2 000)，TBST洗滌后用再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶5000)，化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影，以β-actin為內(nèi)參照。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、不同濃度AcD處理HepG2細(xì)胞和7702細(xì)胞凋亡率和存活率的比較

Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示不同濃度AcD分別處理HepG2細(xì)胞和7702細(xì)胞24 h后均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率增加，且細(xì)胞凋亡率均隨著AcD濃度的升高而升高，其中50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD組細(xì)胞凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。 MTT檢測結(jié)果顯示兩種細(xì)胞存活率均隨著AcD濃度的升高而降低，其中50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD組細(xì)胞存活率顯著低于對照組(P<0.05)，見表2。TUNEL法測定細(xì)胞DNA的片段化，結(jié)果可見50 ng/mL AcD組相比無血清對照組有更多的DNA片段化(圖1)，表明細(xì)胞凋亡增加。因此，研究表明，AcD能夠以濃度依賴的方式促進(jìn)HepG2和7702細(xì)胞的凋亡。

表1 不同濃度AcD處理HepG2細(xì)胞和7702細(xì)胞凋亡率的比較(±s)

注：統(tǒng)計(jì)值為各組與無血清對照組相比較

表2 不同濃度AcD處理HepG2細(xì)胞和7702細(xì)胞存活率的比較(±s)

注：統(tǒng)計(jì)值為各組與無血清對照組相比較

圖1TUNEL法檢測HepG2細(xì)胞的凋亡 A 無血清對照組 B 50 ng/mL AcD處理組

二、5-HT和5-HT 2B受體激動(dòng)劑抑制AcD誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡

Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，50 ng/mL AcD處理HepG2細(xì)胞24 h后的凋亡率為31.96% ±2.13%，5-HT可使50 ng/mL AcD預(yù)處理HepG2細(xì)胞的凋亡率降至10.24% ±2.59%(t=1.62，P<0.05)，5-HT 2B受體激動(dòng)劑M110與5-HT作用相似，使凋亡率降至8.41%±0.96%(t=1.75，P<0.05)，而5-HT 2A受體激動(dòng)劑DOI使細(xì)胞凋亡率上升至32.46%±0.41%(t=1.23，P>0.05)。反之，5-HT 2B受體拮抗劑SB204能拮抗5-HT的抗凋亡作用，其凋亡率為25.92%±1.33%(t=1.45，P>0.05)。MTT法檢測以上各組細(xì)胞存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單用50 ng/mL AcD處理HepG2細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率為75.0%±2.96%，而5-HT、5-HT 2B受體激動(dòng)劑M110使細(xì)胞存活率分別升至88.10%±3.16%(t=1.33，P<0.05)、84.97%±3.22%(t=1.28，P<0.05)，而DOI組、5-HT+SB204組分別為70.95%±4.11%(t=1.33，P>0.05)、72.10%±2.8%(t=1.29，P>0.05)。蛋白質(zhì)印跡法檢測活化caspase3的表達(dá)，結(jié)果顯示50 ng/mL AcD處理HepG2細(xì)胞后活化caspase3的表達(dá)較無血清對照組明顯增多(t=1.45，P<0.05)，以單用AcD組為對照，5-HT和5-HT 2B受體激動(dòng)劑M110使HepG2細(xì)胞活化caspase3的表達(dá)明顯減少(5-HT 組t=0.45，M110組t=0.67，均P<0.05)，而加入5-HT 2A受體激動(dòng)劑DOI、5-HT 2B受體拮抗劑SB204+ 5-HT的活化caspase3表達(dá)均較AcD組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(DOI組t=0.22，SB204組t=0.35，P>0.05)(圖2)。以上結(jié)果均提示100 μmol 5-HT及100 μmol 5-HT 2B受體激動(dòng)劑M110均能夠抑制AcD誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率。

注：1.無血清對照組；2. AcD組；3. AcD+5-HT組；4. AcD + M110組；5. AcD+DOI組；6. AcD+5-HT+SB204組

圖2蛋白質(zhì)印跡法檢測不同處理組HepG2細(xì)胞活化caspase3的表達(dá)

三、5-HT抗凋亡作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路

蛋白質(zhì)印跡法檢測不同處理組的AKT和p-AKT蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示各組的AKT蛋白表達(dá)總量相當(dāng)，和單用AcD組相比，5-HT組和5-HT 2B受體激動(dòng)劑M110組p-AKT蛋白表達(dá)增多(t=0.26，P<0.05)，而5-HT 2B受體拮抗劑SB204組p-AKT蛋白表達(dá)量較單用AcD組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.11，P>0.05)，以上提示5-HT能夠促進(jìn)AKT磷酸化，并且5-HT引起的AKT磷酸化可被5-HT 2B受體拮抗劑SB204所拮抗，提示該途徑可能是通過5-HT 2B受體所介導(dǎo)(圖3)。

注：1.無血清對照組；2. AcD組；3. AcD+5-HT組；4. AcD + M110組；5. AcD+DOI組；6. AcD+5-HT+SB204組

圖3蛋白質(zhì)印跡法檢測不同處理組AKT和p-AKT蛋白的表達(dá)

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，5-HT能夠抑制AcD誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，5-HT和5-HT 2B受體激動(dòng)劑M110可以促進(jìn)肝細(xì)胞AKT的磷酸化，并且此作用可以被5-HT 2B受體拮抗劑SB204所拮抗。表明5-HT很有可能通過5-HT 2B受體介導(dǎo)激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-AKT信號(hào)通路，使肝細(xì)胞凋亡減少。

研究表明，肝炎(病毒性、內(nèi)毒素性、藥物性)、肝缺血再灌注損傷、肝硬化、肝腫瘤等肝臟疾病均與肝細(xì)胞凋亡有關(guān)，抑制肝細(xì)胞凋亡可以改善這些肝臟疾病[2]。隨著研究的深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種凋亡抑制劑可保護(hù)肝細(xì)胞。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，生長激素可以抑制小鼠肝細(xì)胞凋亡。N-乙?；?血清素可通過線粒體途徑保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡，N-乙酰半胱氨酸可抑制線粒體膜磷脂酶的活性從而抑制肝細(xì)胞的凋亡[10，11]。但這些藥物發(fā)揮抗凋亡作用的具體分子機(jī)制尚不十分明確，目前許多藥物研究還停留在實(shí)驗(yàn)室階段。

5-HT是一種具有多種生理功能的物質(zhì)，除了作為神經(jīng)遞質(zhì)以外，還參與血管收縮、炎癥反應(yīng)、血液凝固等多種生理反應(yīng)。在肝臟中，5-HT參與了肝纖維化、肝臟血流調(diào)節(jié)、肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的再生、肝細(xì)胞凋亡等多種生理過程[6-7]。近年來，5-HT作為一種新的抗凋亡因子被越來越多的用于各種體外的研究，Soll等[12]發(fā)現(xiàn)，5-HT保護(hù)血清剝奪引起的HepG2細(xì)胞的自噬。

5-HT受體共有7種，含14個(gè)亞型，其中5-HT2A、2B受體參與細(xì)胞增殖和凋亡。研究證實(shí)，肝細(xì)胞、竇狀內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)5-HT 2A、2B受體，膽管細(xì)胞表達(dá)5-HT 2B受體[13]，另有研究報(bào)道，5-HT 2受體阻斷劑也能夠抑制鎘誘導(dǎo)的大鼠肝組織凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，5-HT能夠使AcD誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡率降低，存活率增加，減少caspase3的活化，起到抗肝細(xì)胞凋亡的作用。為了進(jìn)一步確定受體的類型，研究了5-HT 2A受體激動(dòng)劑DOI，5- HT 2B受體激動(dòng)劑M110，結(jié)果顯示5-HT 2B受體激動(dòng)劑M110同樣也可以顯著抑制AcD誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，而5-HT 2A受體激動(dòng)劑DOI可增加AcD誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，因此推斷5-HT抗肝細(xì)胞凋亡作用可能與5-HT 2B受體有關(guān)，本研究進(jìn)一步通過5-HT 2B受體拮抗劑SB204能夠?qū)?-HT的抑制凋亡作用來證實(shí)這一結(jié)論。

目前公認(rèn)的肝細(xì)胞凋亡信號(hào)通路主要包括細(xì)胞膜死亡受體通路和細(xì)胞色素C釋放、caspase激活的線粒體通路，即外源性途徑和內(nèi)源性途徑[15-16]。在眾多凋亡信號(hào)通路中，PI3K信號(hào)通路參與增殖、分化和凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路在抗凋亡機(jī)制中發(fā)揮重要作用也已為諸多實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[17-18]。PI3K激活后，質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatid- ylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3)，PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白AKT結(jié)合導(dǎo)致AKT的活化。AKT又稱為蛋白激酶B(protein knlase，BPKB)，是一種相對分子質(zhì)量為60 000的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其作為PI3K的下游靶蛋白是一種多功能調(diào)節(jié)因子，激活后能直接磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如激活κB激酶、Bcl-2、Bax蛋白，或者抑制P53和caspase酶，通過調(diào)控這些轉(zhuǎn)錄因子，可以抑制凋亡基因的表達(dá)和增強(qiáng)抗凋亡基因的表達(dá)，起到抗凋亡作用。有研究發(fā)現(xiàn)，AcD誘導(dǎo)7702細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能為其與PI3K/AKT通路上的某一蛋白結(jié)合，從而阻斷AKT蛋白磷酸化及其活性[19]。為了進(jìn)一步研究信號(hào)通路，檢測了AKT和p-AKT的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-HT和5-HT 2B受體激動(dòng)劑均可使AKT的磷酸化增加，這種作用也能被5-HT 2B受體拮抗劑所拮抗，提示5-HT的抗肝細(xì)胞凋亡作用很可能是通過5-HT 2B受體介導(dǎo)的，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而使肝細(xì)胞凋亡減少，為臨床應(yīng)用5-HT制劑抑制肝細(xì)胞凋亡，保護(hù)肝細(xì)胞損傷提供新的依據(jù)。

本研究主要局限在于肝細(xì)胞系尤其是人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞上的研究，缺乏在體實(shí)驗(yàn)的有力支持，尚需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。