韓伊楊 魏志平 杜佳溪 陳嬌

[摘要]目的：探討維生素K3對UVA輻照下角質(zhì)形成細胞的光保護作用及相關(guān)機制。方法：以5J/cm2的UVA輻照HaCaT細胞建立光老化細胞模型。采用不同濃度（0、0.125μM、0.25μM、0.5μM）的維生素K3預處理HaCaT細胞24h;CCK-8方法檢測細胞增殖活性;活性氧（ROS）檢測熒光探針2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）檢測細胞內(nèi)活性氧水平;Western blot法檢測各組細胞MMP1、COX2、LC3B蛋白的表達。結(jié)果：與單純光照組相比，維生素K3能夠促進光老化HaCaT細胞的體外增殖，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;藥物干預組HaCaT細胞的ROS含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;細胞內(nèi)MMP1、COX2蛋白表達降低，LC3B表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：維生素K3能夠?qū)VA輻照HaCaT細胞提供光保護作用，其機制可能與促進細胞自噬有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]HaCaT細胞;光老化;紫外線A;維生素K3;自噬

[中圖分類號]R339.3+8? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）12-0102-04

Protective Effect of Vitamin K3 on Photoaged HaCaT Cells

HAN Yi-yang1，WEI Zhi-ping2，DU Jia-xi1，CHEN Jiao1

（1.Graduate School of Xuzhou Medical University，Xuzhou 221002，Jiangsu，China;2.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University，Xuzhou 221002，Jiangsu，China）

Abstract： Objective? To explore the photoprotective effect of Vit K3 on keratinocytes under UVA irradiation and related mechanisms. Methods? HaCaT cells were irradiated with 5J/cm2 of UVA to establish a photoaging cell model. HaCaT cells were pretreated with Vit K3 at different concentrations （0， 0.125μM， 0.25μM， 0.5μM） for 24h. Proliferation of cells was detected by CCK-8 method. Reactive oxygen species （ROS） detection fluorescent probe 2'，7'-dichlorofluorescein yellow diacetate （DCFH-DA） was used to detect intracellular reactive oxygen level. The expression of MMP1， COX2 and LC3B was detected by Western blot. Results? Compared with the light-only group， Vit K3 could promote the proliferation of HaCaT cells in a concentration dependent manner， the difference was statistically significant （P<0.05）. The ROS content of HaCaT cells in the drug intervention group was lower （P<0.05）. The expression of MMP1 and COX2 protein was decreased， and the expression of LC3B was increased （P<0.05）. Conclusion? Vit K3 could provide photoprotection to HaCaT cells irradiated by UVA， and its mechanism might be related to promoting autophagy.

Key words： HaCaT cells; photoaging; Ultraviolet A; Vitamin K3; autophagy

光老化被認為是紫外線輻射損傷在皮膚老化基礎(chǔ)上的疊加，作為一種退變過程而引起人們的廣泛關(guān)注[1]，尤其是A型長波紫外線（UVA），UVA過度輻照將導致皮膚紅斑生成、ROS異常表達、MMPs、COX-2等生成并導致炎癥發(fā)生，推動光老化[2]。自噬與衰老密切相關(guān)，具有許多共同的特征，在衰老機制的研究中發(fā)現(xiàn)，細胞自噬能夠延緩器官功能退化，這表明兩者在細胞中可能發(fā)揮相似的功能和作用[3]。隨著研究的進展，許多證據(jù)提示：自噬，同樣可能與有機生物體內(nèi)最大的器官-皮膚組織的老化密切相關(guān)。研究證實，自噬可以通過清除UV輻照細胞內(nèi)受損的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，修復DNA，幫助細胞恢復代謝穩(wěn)態(tài)，為光老化受損的皮膚提供保護作用[4]。適度的自噬有助于抑制紫外線損傷皮膚角質(zhì)形成細胞，維持正常的細胞自噬水平有助于抵抗UVA所致的光老化[5]。維生素K3（Vit K3）是一種合成的類似Vit K的物質(zhì)，作為維生素原在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性形式。最近一些研究表明，Vit K3具有誘導細胞自噬的功能[6]。鑒于此，本實驗以人永生化角質(zhì)形成細胞（HaCaT細胞）作為體外UVA輻照光老化細胞的模型，旨在初步探索Vit K3對UVA輻照下角質(zhì)形成細胞的生物學作用，以期進一步為光老化治療的研究提供理論依據(jù)和新的思路。

自噬的失調(diào)可導致多種皮膚病的發(fā)生并導致皮膚衰老[7]。一項角質(zhì)形成細胞中的體外研究發(fā)現(xiàn)，自噬誘導可增強角質(zhì)形成細胞中核因子E2相關(guān)因子2依賴性的抗氧化反應(yīng)[8]。而Atg7基因（自噬相關(guān)基因7）滅活小鼠的體內(nèi)研究中也顯示，在缺乏自噬的情況下，細胞將表現(xiàn)出DNA損傷、細胞周期阻滯和脂質(zhì)表型紊亂等典型的早衰[9]。以上研究均提示，從細胞自噬的角度來了解衰老皮膚的特征，發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用自噬調(diào)節(jié)藥物，對于治療和預防紫外線所致的皮膚疾病具有重要意義[10]。而近年來關(guān)于維生素K3的促自噬效應(yīng)受到了廣泛的關(guān)注。為了闡明維生素K3自噬功能與光老化的關(guān)系，本實驗以體外UVA損傷的HaCaT細胞為光老化模型，進行實驗，首先觀察了紫外線輻射對角質(zhì)形成細胞形態(tài)及生理活性的影響，其次檢測光老化細胞中相關(guān)蛋白標記物的表達，繼而探討維生素K3對光老化模型中HaCaT細胞的作用。

在現(xiàn)有的機制學說認為，UVA輻射通過上調(diào)角質(zhì)形成細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）的表達，誘導破壞細胞外包括膠原蛋白在內(nèi)的基質(zhì)蛋白，從而導致皮膚結(jié)構(gòu)完整性受損[11]。而環(huán)氧化酶-2（COX-2）是一種誘導產(chǎn)生前列腺素的酶，該酶在上表皮高表達，受光、生長因子和細胞因子的調(diào)控[12]。UVA輻射將導致細胞內(nèi)COX-2表達上調(diào)，誘導角質(zhì)形成細胞增殖、表皮增生、炎癥和水腫，加速光老化的進展。在本實驗中，分別檢測了上述光老化損傷的標志性生物分子的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純UVA照射組比較，Vit K3藥物干預組這些標記物的表達得到抑制。該結(jié)果證實了本次假設(shè)，即Vit K3可以減輕UVA誘導的光損傷。

UV已報導可通過下調(diào)細胞中抗紫外線相關(guān)基因（UVRAG）和p53的表達導致自噬溶酶體功能障礙[13]。微管相關(guān)蛋白3（LC3）是一種可溶性蛋白，在哺乳動物組織和培養(yǎng)細胞中廣泛表達，與自噬相關(guān)，反映了自噬活性[14]。為了探究UVA誘導的HaCaT細胞光老化與自噬的聯(lián)系，進行了蛋白免疫印跡實驗。結(jié)果表明，Vit K3的加入在一定程度上恢復了受抑制的LC3-Ⅱ蛋白表達。由此，可以推測UVA誘導HaCaT細胞光老化及Vit K3作用的可能通路：UVA輻射抑制了HaCaT細胞內(nèi)自噬水平，使得自噬介導的細胞自我清除由UVA誘導產(chǎn)生的ROS、COX-2和MMP-1等因子的能力下降，上述因子在細胞內(nèi)發(fā)生異常積聚;而皮膚組織在這些因子的作用下，出現(xiàn)膠原纖維的合成減少、降解增多，炎癥反應(yīng)增多，皮膚組織結(jié)構(gòu)失去完整性，最終疊加在內(nèi)源性老化基礎(chǔ)上，推動皮膚粗糙、干燥、血絲增多等光老化進程[15]。

綜上所述，筆者認為Vit K3不僅可以逆轉(zhuǎn)UVA照射引起的細胞活力下降，還可以抑制光化細胞中的COX-2，MMP1的生成。重要的是，發(fā)現(xiàn)UVA可以抑制自噬，減少LC3-Ⅱ的形成，而Vit K3由于其自噬誘導特性可以抑制這種作用。結(jié)果表明，Vit K3可以通過自噬激活有效地保護HaCaT細胞不受光老化的影響，為Vit K3對抗皮膚光老化的機理提供了可能的理論依據(jù)，以及為Vit K3可能進一步開發(fā)為抗光老化藥物提供了理論基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1]Tobin DJ.Introduction to skin aging[J].J Tissue Viability，2017，26（1）：37-46.

[2]Battie C，Jitsukawa S，Bernerd F，et al.New insights in photoaging， UVA induced damage and skin types[J].Exp Dermatol，2014，23（Suppl 1）：7-12.

[3]Leidal AM，Levine B，Debnath J.Autophagy and the cell biology of age-related disease[J].Nat Cell Biol，2018，20（12）：1338-1348.

[4]Wang M，Charareh P，Lei X，et al.Autophagy： multiple mechanisms to protect skin from ultraviolet radiation-driven photoaging[J].Oxid Med Cell Longev，2019，2019：8135985.

[5]Endo K，Katsuyama Y，Taira N，et al.Impairment of the autophagy system in repetitively UVA-irradiated fibroblasts， photodermatology[J].Photodermatol Photoimmunol Photomed，2020，36（2）：111-117.

[6]Yang C，Han LO.Knockdown of Beclin 1 inhibits vitamin K3 induced autophagy， but promotes apoptosis of human hepatoma SMMC-7721 cells[J].Mol Med Rep，2010，3（5）：801-807.

[7]Guo Y，Zhang X，Wu T，et al.Autophagy in skin diseases[J].Dermatology，

2019，235（5）：380-389.

[8]Zhao Y，Zhang CF，Rossiter H，et al.Autophagy is induced by UVA and promotes removal of oxidized phospholipids and protein aggregates in epidermal keratinocytes[J].J Invest Dermatol，2013，133（6）：1629-1637.

[9]Song X，Narzt MS，Nagelreiter IM，et al.Autophagy deficient keratinocytes display increased DNA damage， senescence and aberrant lipid composition after oxidative stress in vitro and in vivo[J].Redox Biol，2017，11：219-230.

[10]Qiu Z，Kuhn B，Aebi J，et al.Discovery of fluoromethylketone-based peptidomimetics as covalent ATG4B （Autophagin-1） inhibitors[J].ACS Med Chem Lett，2016，7（8）：802-806.

[11]Young AR，Claveau J，Rossi AB.Ultraviolet radiation and the skin： Photobiology and sunscreen photoprotection[J].J Am Acad Dermatol，

2017，76（3s1）：S100-s109.

[12]李鵬琴，張桂云，李雪.皮膚光老化的研究進展[J].中國美容醫(yī)學，2020，29（5）：174-177.

[13]Sample A，He YY.Autophagy in UV damage respons[J].Photochem Photobiol，2017，93（4）： 943-955.

[14]Galluzzi L，Baehrecke EH，Ballabio A，et al.Molecular definitions of autophagy and related processes[J].EMBO J，2017，36（13）：1811-1836.

[15]Savic S，Smiljic S，Lestarevic S，et al.The structural characteristics of photoaging in mice caused by the effects of ultraviolet A radiation[J].Folia Morphol（Warsz），2019.

[收稿日期]2020-07-07

本文引用格式：韓伊楊，魏志平，杜佳溪，等.維生素K3對光老化HaCaT細胞保護作用的研究[J].中國美容醫(yī)學，2020，29（12）：102-105.